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文档简介
1、电泳: 指带电胶体粒子或分子在电场的作用下,作定向移动。 由于各种物质分子的等电点不同在同一P环境中所带的电荷各不相同,再由于分子量、分子结构、形状大小各有差异,因此在同一电场中泳动速度也就不一样。一般来说,所带的电荷多而分子量小、形状越接近球形者,泳动速度快,反之则慢。电泳:电泳技术的分类:主要归纳为; 1)显微电泳即在显微镜下观察胶体粒子或细胞的移动度,也称细胞电泳。 2)自由电泳即悬浮在介质中的细胞和生物大分子,在电场作用下自由定向移动。电泳技术的分类:主要归纳为; 1)显微电泳即 3)区域电泳(区带电泳):即在不同电力条件、支持物上进行直接分离,鉴定生物物质,促使获得各自电荷差异的生物
2、粒子或分子形成各自区域以帯形停留在载体上。如:滤纸、淀粉、琼脂、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等,此类 电泳技术分离技巧简便,运用十分广泛。 4)免疫电泳:即抗原与抗体在比例合适的琼脂糖载体中相结合的一种电免疫技术,亲和电泳即属此类。 3)区域电泳(区带电泳):即在不同电力条件、支根据缓冲液的性质不同可分为: 1.连续系统:电泳缓冲液的离子成分、PH、电位梯度与制胶(或浸膜)缓冲液相同,带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。 2.不连续系统:电泳缓冲液离子成分、pH、电位梯度与制胶(或浸膜)缓冲液不尽相同,带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。根据缓冲液的性质不同可分为: 1.连续系统
3、:电泳缓冲液的离子 血红蛋白(Hb) 的组成及分类: 血红蛋白(Hb):由亚铁血红素、珠蛋白 组成 。每个珠蛋白分子由4条多肽链构成 ,根据其一级结构的不同可分为、四种类型。 血红蛋白(Hb) 的组成及分类:正常成人Hb种类: 组成 百分含量 pIHbA 22 9598% 6.95HbA2 22 23% 7.38HbF 22 6.95 正常成人Hb种类:实验原理(Experimental Principles)在pH8.6的环境中,Hb是一种带负电荷的蛋白质(Hb的pI 8.6),在电场中向正极泳动。电泳时,由于各种Hb等电点不同,所带电荷量不同;分子量大小、形状不同,导致各自的泳动速度不同,
4、因而被分离。这种分离可初步鉴定不同的Hb。实验原理(Experimental Principles)在 醋酸纤维素薄膜是由纤维素的羧基进行乙酰化后而制成的,浸湿后有巨大的张力和柔韧性,几乎对所有生物活性物质均能通过电泳得到分离。 醋酸纤维素薄膜电泳因设备简单、操作方便、电泳时间短、分辨率高、区带分离清晰、无拖尾、易定量等,已成为临床、实验室首选的方法。 醋酸纤维素薄膜是由纤维素的羧基进行乙酰化实验材料、主要仪器和试剂(Equipments , Materials and Agents)1、试剂 0.9%的NaCl溶液;蒸馏水; 四氯化碳;碘酊;75%酒精;TEB缓冲液(pH8.6);丽春红染液
5、;漂洗液。2、实验器材 醋酸纤维薄膜;滤纸;电泳仪;一次性穿刺针;消毒棉签。实验材料、主要仪器和试剂(Equipments , Mate操作步骤(Operating Procedure)1.取血: 用2%碘酊棉球消毒受试者手指,再用75%酒精棉球脱碘,采血针穿刺,取血约0.05ml放入事先已加入0.9%NaCl 1ml 的1.5ml离心管中。如出血不畅,可对手指稍加挤压。操作步骤(Operating Procedure)1.取血:2.制备Hb液:1)洗涤红细胞:将上述离心管,颠倒混匀5-6次,4000rpm,离心3分钟。弃上清,再加1ml 0.9%NaCl悬浮红细胞,相同条件重复离心一次。2)
6、溶血:向红细胞沉淀中加入蒸馏水1 2滴,摇匀,再加入四氯化碳1滴,振荡混匀,相同条件再离心一次,取上清即得Hb液。2.制备Hb液:3.电泳1)膜条准备:2)点样:取出平衡好的膜条,用滤纸吸去多余的液体,然后平铺,(毛面朝上),用小玻片沾取适量Hb液,按印于点样线上,点样处离膜条边缘1.5cm左右。3.电泳3)电泳:在电泳槽内加入缓冲液,膜条点样面向下,上样一端靠近负极,盖严电泳室。通电预电泳5-10min。调节电压为100V,电泳3040分钟。4)染色:电泳完毕后关闭电源。将膜条取下,放在丽春红染色液中染色10分钟。5) 漂洗:取出染色膜条,放入漂洗液中漂洗至凝胶背景无色为止。3)电泳:在电泳
7、槽内加入缓冲液,膜条点样面向下,上样一端靠近结果与分析:(Results and Analysis ) 观察膜条上Hb条带的位置及颜色的深浅。绘图纪录之。 结果与分析:(Results and Analysis ) Hb的醋酸纤维薄膜电泳 临床意义异常血红蛋白: 指珠蛋白链中一个或数个氨 基酸被置换、缺失或增加,造成血红蛋白结构及功能异常,导致一系列病理和生理改变。是常见的遗传病之一. 人类异常血红蛋白高达两千多种类型,约300人中即有一人是异常血红蛋白携带者。因此,在临床上快速、早期诊断尤为重要。 临床意义异常血红蛋白:血红蛋白病分类1.异常Hb病: 基因突变导致珠蛋白结构改变.例如:镰状红细胞贫血.形成原因: 链第6位谷氨酸被缬氨酸取代,形成HbS(镰状Hb)取代了正常的Hb。在缺氧情况下,HbS聚合形成长棒状聚合物,使红细胞镰变,变形能力低,导致溶血、贫血,引起血粘度增高,血管梗阻性继发症状。血红蛋白病分类1.异常Hb病:发病的分子基础是: 链基因的一个碱基对GAG变为GTG,致使血红蛋白的链N端第6位的谷氨酸被缬氨酸取代形成HbS。2.地中海贫血: 基因突变导致珠蛋白肽链合成缺乏或合成量异常,如、地贫。发病的分子基础是: 地中海贫血是由于,珠蛋白基因缺失、突变导致某种珠蛋白链合成障碍,造成链和链合成数量不平衡,引
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