结核分枝杆菌及其实验室诊断新技术

1、结核分枝杆菌及其实验室诊断新技术第1页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三 结核病又称为痨病和白色瘟疫。 公元三世纪以前，我国古代医学还只是认识到该病可能是一种极为严重的慢性传染病，“累年积月，渐就顿滞，以至于死，死后复转旁人，乃至灭门”。以后逐渐认识到这是一种“肺痨”，其病因为“痨虫”所致。 后来，西方的一些科学家发现这类病人的肺内有一个个坚实的团块，摸上去像土豆或花生这类植物的根上块茎，就将该病称之为Tuberculosis，即结节的意思，这就是结核病命名的由来。结核病第2页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三 红楼梦：香魂一缕随风散，愁绪三更入梦遥

2、。 虽然说红楼梦与医学无关，但其作者笔下的“痨病”代表林黛玉却惊动全世界。 上世纪50年代，美国细菌学家杜博斯所写的The White Plague(白色瘟疫)，就曾提到了林黛玉的肺结核，可见在当时红楼梦中林黛玉的病症已是结核病的典型症状。 黄帝内经素问：“大骨枯稿，大肉陷下。胸中气满，喘息不便，内痛引肩项，身热，脱肉破腘。”结核病第3页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三 2011年全球结核病发病率 （世界卫生组织2012年结核病报告）结核病目前仍然是一个全球性的严重的公共卫生问题。结核病第4页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三流行过程传染源 痰涂片

3、阳性的肺结核病人传播途径 空气传播易感人群 普遍易感第二节 流行病特征影响流行的因素自然因素 季节、环境、居室通风社会因素 社会、经济、医疗服务其他因素 HIV-TB，MDR/XDR-TB结核病第5页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三结核病防控的三大手段临床诊断常常结合 痰涂片，胸片，症状和体征结核病世界防治结核病日3月24日第6页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三结核病是由结核分枝杆菌引起的。Robert Koch（1843-1910）1882年发现结核分枝杆菌，1905年获得诺贝尔生理或医学奖。Friedrich Neelsen (1854-18

4、98)Franz Ziehl（1857-1926） Ziehl-Neelsen 染色法（分枝杆菌抗酸染色的基础）结核分枝杆菌第7页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三结核分枝杆菌（一）生物学性状1.形态与染色 细长略带弯曲，分枝状，有荚膜，抗酸染色阳性第8页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三2. 培养与生长特性 特点 专性需氧 生长缓慢 营养要求高，常用罗氏培养基 生长现象 液体：表面生长（菌膜） 固体：颗粒、结节、花菜状菌落 乳白或米黄，不透明3. 生化反应 不发酵糖类 ，触酶试验阳性，而热触酶试验阴性结核分枝杆菌第9页，共23页，2022年，5月2

5、0日，11点56分，星期三4. 抵抗力四不怕干燥碱性染料青霉素等抗生素对酸或碱有抵抗力（3% HCl或6% H2SO4、4% NaOH）四怕乙醇湿热紫外线抗痨药物（异烟肼、利福平等）5. 变异性形态结构变异： 结核杆菌的L型：颗粒状、丝状毒力变异： 卡介苗BCG：Calmette和Gurin 牛分枝杆菌 13年230次 耐药性变异： 耐异烟肼及其他抗结核药物的结核菌株日益增多结核分枝杆菌第10页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三致病物质（二）致病性荚膜与细胞表面受体结合（粘附与入侵作用）含多种酶（分解利用营养物质）保护（阻止有害物质的进入菌体）脂质索状因子（破坏细胞，引起

6、肉芽肿）磷脂（形成结核结节）硫酸脑苷脂（抑制吞噬体与溶酶体结合）蜡质D（引起迟发性过敏反应）蛋白质引起迟发性过敏反应感染方式 呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入机体所致疾病 结核病，以肺结核常见结核分枝杆菌第11页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三（三）免疫性 1. 机体抗结核免疫特点：传染、免疫、超敏反应共存 2. 属于感染免疫(infection immunity)，又称有菌免疫 3. 细胞免疫为主，迟发型超敏反应同时存在 4. 郭霍现象: 注射结核杆菌于豚鼠皮下 初次注射 局部反应小 全身扩散 无免疫无超敏反应 再次注射 局部反应大 不扩散 有免疫有超敏反应 5. 结核菌

7、素试验（OT试验）： 应用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否能引起迟发型超敏反应（型变态反应）的一种试验结核分枝杆菌第12页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三 标本处理：浓缩集菌（氢氧化钠处理） 直接镜检：抗酸染色 分离培养：培养基、时间（24周后见结果）痰液等实验室诊断新技术分离培养（一）传统微生物学检查直接涂片第13页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三实验室诊断新技术（二）TB-Beads技术Liu J, Sun ZQ, Pei H, et al. Increased case finding of tuberculosis fro

8、m sputum and sputum deposits after magnetic bead concentration of mycobacteria. J Microbiol Methods, 2013, 93(2): 144-147.第14页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三（三）核酸分子诊断技术-Xpert MTB/RIF和TB-SAT靶基因菌种鉴定16SrRNA IS6110异烟肼katG、inhA、ahpC、oxyR、KasA、ndh 利福平rpoB乙胺丁醇embB吡嗪酰胺 pncA链霉素 rpsL、rrs喹诺酮类药物 gyrA、gyrB Zhang Y,

9、 et al. Nature, 1992, 358(6387): 591-593.Scorpio A, Zhang Y. Nat Med, 1996, 2(6): 662-667.实验室诊断新技术第15页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三基因水平-PCR技术1. Xpert MTB/RIFIndorsed by WHO in 2010.实验室诊断新技术第16页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三2. TB-SAT技术Simultaneous Amplification and Testing（RNA仁度）RNA作为临床分子诊断靶标的优点 RNA 拷贝数

10、 DNA拷贝数 更具临床意义 生命力旺盛的病原体RNA转录活跃 RNA远不如DNA稳定 病原体死亡，RNA很快降解 1.交叉污染少 2.较好的愈后指标实验室诊断新技术第17页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三恒温扩增-SAT技术TB-SAT技术原理实验室诊断新技术第18页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三TB-RNA提取恒温扩增实时检测60C 10 min42C 5 min超声仪（300W）15 min痰液预处理42C 40 min50 ul 稀释液TB-SAT操作步骤实验室诊断新技术第19页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三培

11、养鉴定结果+PCR结果合计TB-SAT检测结果阳性阴性阳性2317238阴性12318330合计243325568敏感度=231/243100%=95.06%特异性=318/325100%=97.85%准确度=(231+318)/568 100%=96.65%恒温扩增-SAT技术TB-SAT检测的敏感度和特异性实验室诊断新技术第20页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三（四）蛋白分子诊断技术-干扰素释放实验结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否

12、正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。基于IGRA原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、法国、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中（IGRA，interferon- gamma release assay）实验室诊断新技术第21页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三检测过程与结果判断阴性结果阳性结果空白对照抗原 A抗原 B阳性对照（PHA）实验室诊断新技术第22页，共23页，2022年，5月20日，11点56分，星期三美国FDA认证临床实验数据 经培养确诊的结核病患者样本183例 敏感度 95.6%(175/183) 306例入伍新兵 特异性 97.1%(297/306)T.SPOT.TB 检测的敏感度和特异性国内临床实验数据T-S