白细胞预激与非适应性反应的实验研究

1、白细胞预激与非适应性反响的实验研究【摘要】目的观察中性粒细胞粘附活性和杀伤效应在大鼠严重创伤后的动态变化规律，讨论中性粒细胞致敏与活化不同功能状态下的生物学标记对创伤的预警意义。方法采用多处骨折和广泛软组织挫伤建立大鼠严重创伤模型，分别于创伤后2、4、8、12、24h不同时相点采集血标本；攻击组于体外LPS攻击PN模拟“二次打击；检测各组PN释放2-和PN-E的粘附活性的变化。结果创伤组2、4h时相点中性粒细胞体外自发释放2-自由基量和PN-E粘附活性与根底表达值无明显改变，8、12、24h时相点明显增多P0.05，而8、12、24h时相点那么显示上述指标均较对照组明显增加；LPS攻击组显示各

2、相应时相点2-自由基释放量、PN-E粘附百分率均较其对照组呈不同程度升高；尤其是2、4h时相点较同组其他时相点增加更为明显P0.01，且较创伤组明显增加P0.01。结论创伤早期PN处于致敏状态，表现为活性氧的释放才能显著增加和PN-E的粘附活性明显上调。【关键词】创伤中性粒细胞预激致敏活化内毒素大鼠【Abstrat】bjetiveTbservatethehangesfrelease2-fPNandPN-Eadhesinativityatratsithultipletraua.Itsvaluablethatprvidingtheretialinstrutinfrlinialtreatent,an

3、dexpetinganeradfrpreventinandtreatentfsevereinjurybyexplringtheehanisandbiarkerfPNpriing.ethdsAdptingurinedlesfultiplebrken-bneandsfttissueinjury,thebasallevelsfPN2-releaseerefundinunstiulatedPNharvestedfrhealthrats.Systeibldaslletedat2、4、8、12、24haftertraua.ithLPShallengethePNharvestedatvariustiesin

4、vitrsendhit.Theethdsusedinthestudyareasflls:1.Invitrrelease2-fPNasessuredbyultraviletspetrspy.ResultsPN-Eadhesinativityandspntaneusinvitr2-releasebyPNharvestedfrtrauaratsat2and4hursafterinjuryasalsquitel.Inntrast,hihdestlyinreasedat8,12and24hursafterinjury(P0.05),theabvehangesallreainedhigherthantha

5、tfntrlgrupat8,12and24hursafterinjury.Als,LPShallengePNsthatexpressedre2-thanntrl,espeialysignifiantelevatinsat2hurs、4hursafterinjury,paredithntrlgrup,PN-Eadhesinativityallerearkedlyenhanedatvariustiesafterinjury,espeialythedentesdataat2and4hurs,thataresignifiantlydifferent(P0.01)frthethervariusties.

6、nlusinTheinjurytPNasarlefpriingearlytraua,andPNbeepriedfrenhanedsuperxidereleaseandtheup-regulatinfPN-Eadhesinativity.【Keyrds】traua;neutrphilgranulyte;priing;pried;ativatin;endtxin;rat中性粒细胞PN存在三个功能状态，即静息quiesent、致敏pried、活化ativited1。机体受到伤害的早期，创伤作为初始刺激对PN产生预激Priing作用使PN处于致敏状态，对随后的刺激产生应答反响即进入活化或过度活化状态。

7、本实验观察白细胞对创伤预激的非适应性反响的变化规律，为讨论创伤后全身炎症反响综合征SIRS的预警意义拓展一个新思路。1材料与方法11实验动物及创伤动物模型制备安康成年Sprague-Daley大鼠90只，体重25030g，雌雄不限，由第二军医大学实验动物中心提供。本实验动物模型参照文献2方法作改良。动物术前12h禁食，自由饮水；伤后不限制进食、饮水。用自制的夹钳夹大鼠的肢体，造成双侧股骨+双侧胫腓骨+双侧肱骨的多发性闭合型骨折和软组织挫伤，建立创伤动物模型。12主要试剂及器材LPS由Siga公司提供；氯化硝基四氮唑蓝(NBT)为上海前进试剂厂产品；Perll细胞别离液、DextranT500为

8、Pharaia公司产品；DU-640型紫外分光光度计由美国Beken公司消费。13实验方法131实验分组创伤组(Traua)(n=6)：创伤后不同时相点采集血标本别离PN；LPS攻击组(hallenge)(n=6)：创伤后不同时相点采集血标本别离PN+体外LPS(100ng/l)攻击；对照组(ntrl)(n=6)：以上各实验组分别设相应的对照；除未致伤大鼠外，余处理方法与各对应实验组一样。132标本采集实验动物随机分组(n=6)；分别于创伤后2、4、8、12、24h不同时相点断头活杀采集血标本，经Perll梯度离心法别离中性粒细胞，制成1107ells/l细胞悬液。中性粒细胞的别离及PN纯度活

9、力鉴定根本方法见Haslett法3，采用Haslett法测定的PN纯度及活力均92%。133内皮细胞培养及鉴定采用大鼠主动脉血管组织块贴壁法参考文献4方法作改良。实验所用内皮细胞为传代培养第五代，并经PAP法鉴定因子相关抗原无阴性缺损区。134PN产生2-自由基的测定利用紫外分光法检测2-自由基，根据文献5方法以氧化型NBTNBT+间接表示2-生成量。135PN-E粘附活性的测定根据文献6方法检测中性粒细胞与内皮细胞的粘附率表示其粘附活性。粘附率=粘附前的细胞计数洗脱液细胞计数粘附前的细胞计数100%。14统计学分析实验结果以均数标准差xs表示，采用Base统计软件包进展完全随机资料的方差齐性

10、检验F检验，组间计量资料均数比拟均采用t检验。2结果21创伤后大鼠PN产生2-的动态变化创伤组2、4h时相点PN释放2-自由基量无明显变化；8、12、24h时相点明显高于对照组P0.05；攻击组各时相点2-自由基量较其对照组均显著升高，尤其是2、4h时相点相差非常显著P0.01；与创伤组相应的时相点比拟相差非常显著P0.01Fig.1。22创伤后大鼠PN-E粘附活性的动态变化创伤组2、4h时相点PN-E粘附百分率与其对照组比拟无明显变化，8、12、24h时相点明显增加P0.05；攻击组各时相点PN-E粘附百分率较其对照组均显著升高，尤其是2、4h时相点升高显著P0.01，且明显高于创伤组P0.

11、01Fig.2。注：*P0.05P0.01vsntrl*P0.01vs8，12，24h注：*P0.05P0.01vsntrl*P0.01vs8，12，24h3讨论3.1创伤动物模型的建立自1992年DEith提出二次打击学说以来，利用二次打击建立标准化的和符合临床实际的创伤后双向迟发DS动物模型一直是创伤引发SIRS、DS、F研究中的难题7。迄今为止，创伤后DS动物模型与临床DS的最大区别在于动物遭受致伤因素打击后没有强有力的器官支持措施，因此难以度过最初的休克或单器官衰竭而早期死亡，使可能开展到DS的自然过程中断。本实验参照文献2方法，建立严重创伤或多发性创伤动物模型。以创伤作为初始打击，体

12、外用LPS攻击从创伤后大鼠血液中获得的中性粒细胞，以模拟内毒素对PN的二次打击sendhit8。实验动物采用同系SD大鼠，个体差异小，采用自制的可控性夹钳为致伤工具，确保各动物的致伤程度一致，以减少系统误差；根据简明创伤分度AIS评分四肢多发性长骨闭合型骨折为严重创伤，所以本实验以夹钳致伤大鼠六处骨折和软组织挫伤，造成大鼠的严重创伤作为对机体的第一次打击firsthit，刺激因素较单一，根本排除了象临床上液体复苏、药物治疗等干扰，同时也表达了以动物作为实验对象的优点，更有利于研究工作对实验条件的控制。3.2PN预激及其功能状态的变化一个细胞对初次损害有准备称预激Priing9，预激是指一个细胞

13、首先接触不利因素并能改变该细胞对随后刺激的应答反响，初始刺激可导致其对损害的构建适应性和损害的非适应性反响，从而表现为细胞的各种功能状态。PN存在三个功能状态1，即静息quiesent、致敏pried、活化ativited。在生理情况下，由于炎细胞的活化有明显的自限性，机体内中性粒细胞PN的发生、激活、灭活、凋亡都维持在平衡程度。然而，机体受到伤害的早期，创伤作为初始刺激对PN产生预激作用使PN处于致敏状态，Hallett10把致敏比方交通路口的“黄、绿灯，此时细胞信号亮起了“黄灯，等待更进一步刺激，一触即发，进入活化或过度活化状态；内毒素LPS可充当这一过程的触发剂，Gebhard等研究发现

14、多发伤的早期血浆中即可能出现内毒素，而且这是严重创伤引发SIRS和F的高危因素11。有研究提示PN体外释放2-自由基量反映其在体循环时的功能状态13。本实验观察到：创伤组2、4h时相点PN体外自发释放2-自由基与对照组比拟，无明显变化；随着创伤后的时间逐渐延长，8、12、24h时相点PN释放2-自由基明显增加，与对照组比拟差异有显著性P0.05,表示PN进入活化状态。攻击组各时相点PN体外自发释放2-自由基较对照组均显著升高，尤其是2、4h时相点相差非常显著P0.01，与创伤组相应的时相点比拟相差非常显著P0.01，由此显示PN已过度活化，而此时相点PN先前在体即处于致敏状态。结果提示创伤早期

15、PN致敏状态表现为活性氧的释放才能明显增加；在创伤对PN预激的根底上再以LPS攻击即进入活化或过度活化状态，其释放2-自由基有放大效应；PN致敏与活化是炎症反响的一个必须的组成局部，同时也给机体造成一个“易损窗(vulnerableind)。3.3PN致敏与粘附活性的关系PN粘附、穿越血管内皮细胞E向炎症部位游走是急性炎症损伤过程的重要特征，是导致组织损伤的先决条件，其分子根底在于PN与E外表黏附分子a-1、IA-1的互相作用12。在PN静止、致敏、活化三个功能状态的变化过程中，致敏作为PN活化和过度活化的预备状态，外表黏附分子a-1的表达及其粘附活性的变化显得尤为重要。本实验观察到创伤组2、

16、4h时相点中性粒细胞PN-E粘附百分率与其对照组值无明显变化，8、12、24h时相点各指标均呈不同程度上调；而攻击组显示与创伤组相对应的时相点指标均有不同程度升高，尤其是2、4h时相点PN-E粘附活性呈同步大幅度上调。由此可见，创伤早期2、4h，PN经创伤预激作用后处于致敏状态，PN与E粘附的储藏力明显增加。3.4PN致敏的机制及其功能调控初始刺激对PN的预激作用使PN致敏，导致其功能变化产生放大效应，这种致敏与再次活化作用不同的细胞内机制，目前尚不清楚，而创伤预激使其信号转导系统的改变更为受到人们的关注13。胞内a2+作为第二信使参与创伤后PN介导的许多生理、病理过程，是PN激活、粘附和游走

17、所必需的。磷脂酶PL激活是信号转导的经典途径，PL激活后产生双信使IP3、DG，IP3能与内质网/肌浆网钙库上作为IP3受体的a2+通道结合，导致a2+通道的开放，使钙库释放，胞内a2+浓度升高；粘附斑14FA为细胞与细胞外基质通过整合素介导粘附的一种构造，粘附斑酶FAK是整合素信号转导中的关键酶，FAK激活后又可进一步激活多条细胞内的信号转导途径，其中包括使细胞内a2+浓度升高。作为第二信使的胞内a2+浓度升高是启动a-1和细胞色素b558ytb558NADPH氧化酶的亚单位聚集、发动及转膜、表达的关键因子，使中性粒细胞对刺激产生一系列应答反响，从而表现为致敏、活化或过度活化的不同功能状态；

18、创伤早期对PN的预激，其胞内a2+浓度升高可能是PN致敏的重要因素之一。活化的PN是一把双面刃，既参与机体防御功能和免疫反响，同时又可带来组织的继发性损伤。近年来，通过调控白细胞的功能防止PN过度活化，使其活化保持在有利于机体的程度上，尤其受到人们的重视。使用钙拮抗剂抑制PN的过度活化有待进一步研究，期望在白细胞激活的初始阶段调控其功能，减轻由PN过度活化导致组织器官损伤，对机体产生一定的保护作用。【参考文献】1HallettB，LlydsD.Neutrphilpriing:theellularsignalsthatsayaberbutntgreenIunl-Tday.1995，16(6):2

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20、uannytesandarphages.AJHeatl，1978，4:1.6harIF.Adhansinfhuanplyrphnulearleukytesyendthelialnlayers;effetsfteperaturediralentatins,andhetatifatrnthestrengthfadhereneeasuredithaneentrifugatinassay.Bld，1985，65(2):473.7HuSen,SHENGZhi-yng,ZHUBa-tng,etal.Studyndelayt-phaseultiplergandysfuntinsyndre.hinedJ,1998,111:101-108.8IngallsRR，Arnau