超声介导微泡造影剂对人HUVEC活性的影响

1、超声介导微泡造影剂对人HUVEC活性的影响【摘要】目的讨论超声介导不同浓度微泡造影剂(SnVue)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVE)活性的影响。方法应用TT比色法检测不同浓度SnVue对HUVE活性的影响。结果超声介导下，随着SnVue浓度的增加，活细胞数呈减少趋势。结论超声介导下不同浓度SnVue对HUVE的活性有着不同的影响。【关键词】超声；微泡造影剂；人脐静脉血管内皮细胞【Keyrds】Ultrasund；BA；HuanubilialvEInendthelialells(HUVEs)新近研究发现微泡造影剂BA可成为基因治疗的一种平安、有效的载体。但是，假如超声剂量过大，或BA浓度过高时，

2、利用超声介导BA实现基因的定向转移这一技术同样也会对机体产生一定的有害的生物学效应。影响BA介导基因治疗效果的因素很多，除不同组织和基因种类的影响外，超声能量、辐照时间、基因与微泡比例等诸多因素均可对基因治疗产生影响。本研究通过观察超声介导BA对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞HUVE的作用，讨论应用超声介导BA对HUVE活性的影响。1材料与方法1.2实验方法1.2.1细胞培养含10%FBS的1640细胞培养液培养HUVE，每12d换液1次，每34d传代1次。1.2.2SnVue的配制1.68l注射用生理盐水0.9%Nal参加SnVue药瓶中每瓶含SF659g，冻干粉25g，剧烈震荡20s至瓶内

3、药物混合均匀后备用此时SnVue浓度为50g/l，以下称初SnVue。1.2.3体外实验TT比色法测定不同浓度SnVue对HUVE活性的影响1.2.3.1实验分组按照添加SnVue浓度不同分为A组：每孔加初SnVue浓度为50g/l50l。B组：将初SnVue稀释2倍后浓度为25g/l，每孔加50l。组：将初SnVue稀释3倍后浓度约17g/l，每孔加50l。D组：将初SnVue稀释4倍后浓度为12.5g/l，每孔加50l。E组：对照组，每孔加生理盐水50l。F组：空白对照组，不加细胞和SnVue，每孔加200l培养液。以上6组每组8孔。1.2.3.2实验步骤1培养细胞参加条件：用0.25%胰

4、酶消化单层培养细胞，用含10%FBS的1640培养液配成细胞悬液，以每孔含104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积150l。如上所述，每组参加不同浓度的SnVue，然后超声辐照，培养皿固定于37水浴箱水面，探头距培养皿底部约30。辐照条件：超声机械指数1.4，辐照时间为60s。2培养细胞：经上述处理后将细胞培养板放入2孵箱，在37、5%2及饱和湿度条件下，培养20h。3呈色：培养20h后，每孔参加TT溶液10l，37，继续孵育4h，终止培养，仔细吸弃孔内培养上清液。然后每空参加DS150l，振荡10in。4比色：在酶联免疫检测仪上选定490n波长，测各孔光吸收值，记录结果。整个实验重复3次。

5、TT测细胞活性，E组细胞的存活率为100，AD组细胞的存活率=每组细胞的吸光值/E组的吸光值100%。1.3统计学处理计量资料采用xs表示。使用SPSS12.0软件作方差分析。2结果2.1IS观察正常生长的HUVE大部分贴壁。早期细胞呈多角、球形，少数细胞伸展，2448h生长最快，逐渐生长成梭形，有些细胞排列呈鱼贯状相连，间有旋涡状排列。核明晰，呈圆形或椭圆形，核分裂相多见，12核仁，胞浆丰富，内含小颗粒。于23d后交融，57d胞体呈多角形，互相嵌合，为单层呈铺路石状排列。见图1。图中箭头所示皱缩、致密度高的细胞为凋亡细胞图1传代后第5天HUVE1002.2TT比色法测定不同浓度SnVue对H

6、UVE活性的影响不同浓度SnVue对HUVE活性的影响不同。超声介导初SnVue及其稀释2倍时细胞存活率较低，分别为639%及659%；初SnVue稀释3倍时细胞存活率增高8811%，且与前两者比拟有显著差异P0.01，初SnVue稀释4倍905%与稀释3倍时比拟，对细胞存活率无显著影响P0.05。转贴于论文联盟.ll.3讨论本研究说明，在超声介导下不同浓度SnVue对HUVE活性的影响不同。随着SnVue浓度的增加，存活细胞百分比呈减少趋势。这说明，超声介导下不同浓度SnVue对HUVE的活性有着不同的影响。超声介导BA这一技术应用于基因治疗是因为它的理化性质可以产生特有的生物学效应，主要是

7、声空化效应。空化效应是指液体中的微小气泡核在超声波作用下被激化，表现为泡核的振荡、生长、收缩及崩溃等一系列动力学过程，这一过程可以把声场能量高度集中于极小的空化泡内，并在空化泡快速闭合的瞬间产生放电、发光、高温、高压、高能量、冲击波、微射流及微聚变等物理和化学效应。在该过程中，周围组织的细胞壁和质膜被击穿产生可逆或不可逆的小孔。本研究采用的SnVue为内含不同气体的微气泡，能降低超声波的空化阈值，增强空化效应。超声介导SnVue可对靶细胞产生一系列生物学效应，其中的空化效应可使细胞膜通透性增加1，2。SnVue内含的微气泡能增强空化效应并降低空化效应的阈值3，4。空化效应一方面使细胞膜外表出现可逆性小孔，细胞膜的通透性增高，外源基因较容易地经细胞膜上的小孔进入细胞内；同时又使SnVue破坏后在部分高浓度地释放出所携带的基因，从而增强外源性基因的摄娶转染和表达；另一方面又能损伤组织和细胞。Skyba等5用活体显微镜观察大鼠斜方肌血管，在输入SnVue之前，超声辐照没有引起微血管的破坏，仅输入SnVue不进展超声辐照，也未引起微血管的破坏，只有输入SnVue同时进展超声辐照，才发现直径7微血管的破裂，血细胞外渗到组织间隙，这种效应与使用超声辐照的机械指数呈正相关。iller等6研究了超声波对人体表皮癌细胞的损害，发现癌细胞的破坏与是否使用微泡关