羧基荧光素乙酰乙酸对大鼠骨髓间质干细胞体外染色的研究

1、羧基荧光素乙酰乙酸对大鼠骨髓间质干细胞体外染色的研究【摘要】目的讨论活体染料羧基荧光素乙酰乙酸FSE标记大鼠骨髓间质干细胞Ss的可行性和最适条件。方法清洁型SD大鼠20只，用密度梯度离心结合贴壁法别离、纯化、培养大鼠Ss，取长满2525培养瓶瓶底的第3代大鼠Ss，用2.5，5，10，20，40l/L的FSE分别作用1，5，10，15，20in后染色，通过观察染色后细胞荧光强度和细胞贴壁率挑选出FSE标记大鼠Ss的最正确标记时间和标记浓度。采用TT法检测最正确条件FSE标记的大鼠Ss的增殖才能。结果浓度10l/L的FSE在37下孵育10in为Ss染色、观察和研究的最正确条件。此条件下，FSE标记

2、的Ss的增殖才能不受影响。结论活体染料FSE是一种标记率高、细胞毒性孝操作简便的标记大鼠Ss的新方法，浓度10l/L的FSE在37下孵育10in为FSE标记大鼠Ss的最正确条件。【关键词】荧光素；乙酰乙酸盐类；骨髓细胞；间质干细胞；染色与标记；大鼠1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物选用清洁级安康雄性SD大鼠20只，23月龄，体质量150250g福建医科大学实验动物中心提供，合格证号SXK(闽20220008)。1.2方法1.2.2FSE染色及最正确条件挑选2.5gFSE用500L二甲基亚枫DS溶解，制成10l/L的储存液，放于20冰箱内保存。临用前取适量，用Ss培养基分别稀释成2.5，5

3、，10，20，40l/L的不同浓度。取长满2525培养瓶瓶底的第3代大鼠Ss26瓶，其中1瓶做等量空白对照，其余25瓶分5组，每组5瓶，分别参加含不同浓度FSE的Ss培养基5L，置37培养箱分别孵育1，5，10，15，20in。用PBS漂洗3次，490n激发波长荧光显微镜下观察FSE标记情况。标记率为：标记率暗视野所见发绿色荧光的细胞数/明视野所见的细胞数100530n发射波长激光共聚焦显微镜下测定细胞荧光强度每瓶随机取10个细胞。随后用0.25%胰酶含0.1%EDTA液1L消化，离心管离心1000r/in,2in。弃去上清，用含10%FBS培养基6L吹打成单细胞悬液。每瓶取1L悬液进展台盼蓝

4、染色，观察Ss的存活率：存活率光镜下活细胞数/总细胞数100其余悬液按12的比例接种于2525培养瓶中，24h后观察记录Ss的贴壁率：贴壁率(倒置相差显微镜下接种细胞数未贴壁的细胞数)/接种细胞数100上述步骤重复4次，通过统计学分析挑选出FSE标记大鼠Ss的最正确标记时间和标记浓度。1.2.3标记细胞增殖才能检测取第3代Ss接种于96孔板中，每孔体积100L，细胞数为1103。实验分2组：FSE标记组选用最正确标记时间和标记浓度的FSE进展标记和未标记组，每组35孔，每天一样时间每组各取5孔细胞，参加TT溶液20L5g/L,37培养箱孵育4h后用全自动酶标仪在490n波长测定其光吸收值D49

5、0，连续7d，并绘制生长曲线。1.3统计学处理数据以xs表示，采用SPSS13.0统计软件包对所得数据进展t检验和单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1Ss的体外培养与鉴定Ss培养24h后逐渐贴壁，其他血细胞通过换液逐渐除去，此时贴壁细胞共同特点是呈巨单核细胞，细胞形态不一，可有梭形、多角形或星芒状突起，为单个或多个细胞的克隆，细胞增殖迅速。1214d，90%细胞交融，交融细胞均呈梭形图1，原代可获得11062106个SS。体外扩增5代细胞数约为11011个Ss。流式细胞仪检测10份第2代细胞样本，结果显示：D34、D45表达阴性，D29、D90表达阳性。图1原代大鼠骨髓间

6、质干细胞形态相差显微镜，100略Fig1RatsSsfpriarygeneratin(phasentrastirspe,100)2.2FSE标记结果FSE标记各组Ss后，荧光显微镜下观察，所有细胞都被标记呈绿色荧光，标记率达100。整个细胞包括细胞膜、细胞质和细胞核都被标记上绿色荧光图2A,2B。台盼蓝染色结果说明，FSE标记的各组Ss的存活率为100图2。A.明视野倒置荧光显微镜，100；B.暗视野倒置荧光显微镜，100；.台盼蓝染色光学显微镜，40.图2羧基荧光素乙酰乙酸标记的第三代大鼠骨髓间质干细胞略Fig2RatsSsf3rdgeneratinlabeledithFSE2.3最正确染色

7、条件挑选结果FSE标记各组Ss的贴壁率和荧光强度分别见表1，2。5种浓度的FSE分别作用1,5,10,15,20in，其细胞贴壁率差异具有统计学意义，作用15in和20in组细胞贴壁率明显低于其它3组F=62.429，P0.01，进一步单因素方差分析显示，1，5，10in3组差异无统计学意义(F=2.176,P0.05)，而20in组细胞贴壁率明显低于15in组F=67.826，P0.01。各组Ss的荧光强度差异具有统计学意义，作用10，15，20in组荧光强度明显高于其它2组F=87.571，P0.01，进一步单因素方差分析显示，10，15，20in3组差异无统计学意义(F=2.478,P0

8、.05)，而1in和5in组差异有显著性意义F=147.357，P0.01，5in组荧光强度明显高于1in组。因此选择10in作为最正确染色时间。5种不同浓度的FSE染色10in，其细胞贴壁率的单因素方差分析显示差异具有统计学意义，2.5，5，10l/L组细胞贴壁率明显高于其它2组F=72.265，P0.01，进一步单因素方差分析显示，2.5，5，10l/L3组细胞贴壁率差异无显著性意义(F=1.957,P0.05)；5种不同浓度的FSE染色10in，其荧光强度的单因素方差分析显示差异具有统计学意义F=78.313，P0.01，荧光强度随着浓度增加而增强。因此选择10l/L作为最正确染色浓度。2.4最正确条件FSE标记的Ss的增殖才能最适条件FSE标记组和未标记组的光吸收值D490差异无统计学意义配对t检验，P0.05，说明在最适条件下，FSE标记的Ss的增殖才能不受影响。2组的生长曲线见图3。表1不同浓度、不同作用时间羧基荧光素乙酰乙酸标记的髓间质干细胞贴壁率略Tab1AdhesiveratefSsafterlabeledbyFSEithdifferentnentratinsanddifferentinubatintien=50.表中数据为%.转贴于论文联盟.ll.表2不同浓度、不同作用时间羧