生物大分子相互作用分析技术(基础医学与医学实验技术)课件

1、4_生物大分子相互作用分析技术(基础医学与医学实验技术)4_生物大分子相互作用分析技术(基础医学与医学实验技术)4_生物大分子相互作用分析技术(基础医学与医学实验技术)第六章 生物大分子相互作用 分析技术基础医学院刘 芸勇敢4_生物大分子相互作用分析技术(基础医学与医学实验技术)4_第六章 生物大分子相互作用 分析技术基础医学院刘 芸第六章 生物大分子相互作用 分析技术基础医学院刘 芸 第一节 生物大分子相互作用分析的意义 第二节 常见的生物大分子相互作用分析方法 第三节 生物大分子相互作用分析新进展（FRET、SPR）主要内容 第一节 生物大分子相互作用分析的意义主要内容真核生物细胞 euk

2、aryotic cell原核生物细胞 prokaryotic cell细胞结构 cell引言真核生物细胞 eukaryotic cell细胞结构 ce原核生物细胞结构肽聚糖被膜质膜引言原核生物细胞结构肽聚糖被膜质膜引言动物细胞植物细胞细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核真核生物细胞结构引言动物细胞植物细胞细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核真核生物细胞结细胞中的大分子 Macromolecules in CellsThe approximate composition of a bacterial cell.引言细胞中的大分子 Macromolecules in Cel分子水平DNAsequencePro

3、teins Structure Function?All Cell 第一节 生物大分子相互作用分析的意义分子水平DNAProteins?All Cell 第一节 DNAPrimary transcriptmRNAmRNAInactivemRNAproteinnucleuscytoplasmTranscriptionalcontrolPost-transcriptionalcontrolmRNA degradationcontroltranslationcontrolactiveproteinPost-translationcontrol基因表达的调控层次DNAPrimary mRNAmRNAI

4、nactiveproProtein complexSignaling net work生命机制Protein complexSignaling net w蛋白质组学的分类 表达蛋白质组学Quantitative study of protein expression between samples that differ by some variable 结构基因组学Goal is to map out the 3-D structure of proteins and protein complexes 功能蛋白质组学To study protein-protein interaction,

5、 3-D structures, cellular localization and PTMs in order to understand the physiological function of the whole set of proteome.蛋白质组学的分类 表达蛋白质组学蛋白质结构和序列特点蛋白质进化过程和保守序列蛋白质表达谱蛋白在细胞内的定位及其相关联的细胞器或结构蛋白质翻译后修饰情况了解与其相关联的其他细胞蛋白质蛋白质信息的不同层次蛋白质结构和序列特点蛋白质信息的不同层次蛋白质同源二聚体(homodimer)蛋白质异源二聚体(heterodimer)蛋白质多聚体(polyme

6、r)蛋白质-DNA复合物(protein-DNA complex)蛋白质-脂质复合物(protein-lipid complex)蛋白质-RNA复合物(protein-RNA complex)DNA-DNA复合物(DNA-DNA complex)生物大分子复合物的类型蛋白质同源二聚体(homodimer)生物大分子复合物的类型第二节 生物大分子相互作用分析技术 1. 研究思路2. 分类3. 技术介绍第二节 生物大分子相互作用分析技术 1. 研究思路生物大分子相互作用分析研究思路鉴定与目标分子相互作用的所有可能大分子详细描述其生物功能及相互作用对其功能的影响鉴定出相互作用且在生理状态下得到了验证

7、和合理的解释生物大分子相互作用分析研究思路鉴定与目标分子相互作用的所有可生物大分子相互作用分析技术(基础医学与医学实验技术)课件GST 融合蛋白技术(GST pull-down)免疫共沉淀(Immunoprecipitation, Co-IP )串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification，TAP)酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid)噬菌体展示(Phage display)细胞内蛋白质共定位(Co-localization)荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)表面等离子共振(surfa

8、ce plasmon resonance，SPR)生物大分子相互作用分析技术GST 融合蛋白技术(GST pull-down)生物大分子1.GST融合蛋白技术 （GST pull-down assay）基于重组蛋白表达纯化技术的体外分析系统基本原理：是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获

9、得。 GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)1.GST融合蛋白技术 （GST pull-down assGST pull-down assayPurification of proteinGlutathione columnGlutathione beadGST fusion proteinGST pull-down assayGlutathioneTags Pull-Down 方法的组成RtagbaitpreyResin树脂Bait诱饵蛋白Prey捕获蛋白Tags 标签（GST, His, Flag, HA, MBP）Tags Pull-Down 方

10、法的组成RtagbaitpRPull-down experimentRWashRRAdd preyWashElutionAnalysisBaitPreyControlsRAdd preyWashRRElutionAnalysis S CSDSgel实验设计思路RPull-down experimentRWashRRAdGSTXY谷胱甘肽-琼脂糖微珠细胞裂解物 tube4下孵育2h GST融合蛋白GSTXY+实验流程GSTXY谷胱甘肽-琼脂糖微珠细胞裂解物 tube4下孵育GST pull-down 应用鉴定未知相互作用的蛋白鉴定预测的或已知的相互作用GST pull-down 应用鉴定未知相互

11、作用的蛋白GST pull down验证两种已知蛋白质（X-Y）的相互作用举 例inputGSTY-GFP + + +X-GSTY-GFP105kDAnti-GFPX-GFP + + +GSTinputAnti-GFPY-GSTX-GFPGST pull down验证两种已知蛋白质（X-Y）的相互2. 免疫共沉淀（ immunoprecipitation，Co-IP ）非常有效地用于鉴定细胞内生理上的蛋白质相互作用的分析技术 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互

12、作用的有效方法。2. 免疫共沉淀（ immunoprecipitation， 基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。GagaroseGagaroseXYGagarose 基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内实验设计思路实验设计思路实验流程SDSProtein A/GSepharose诱饵蛋白质抗体离心诱饵蛋白质Protein A/GSepharose离心传统方法交联方法实验流程SDSProtein A/G诱饵抗体离基础：细胞在非变性条件下裂解时，完

13、整细胞内许多蛋白质之间的结合保持下来。要求：在一系列操作过程中保持蛋白质复合体不变缺点：可能检测不到细胞内处于动态平衡中的低亲和与瞬间的相互作用,存在着免疫球蛋白的污染，需要培养大量的细胞局限：仅应用于从细胞中溶解出来仍存在于生理复合物中的蛋白质基础：细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内许多蛋白质之间的结Co-IP 应用鉴定已知蛋白质相互作用的检测鉴定新蛋白质间的相互作用Co-IP 应用鉴定已知蛋白质相互作用的检测免疫共沉淀验证两种已知蛋白质的相互作用Y-GFPY-GFP+X-HAIP: HA control IgGAnti-GFPAnti-GFPAnti-HAY-GFPinput举 例免疫共

14、沉淀验证两种已知蛋白质的相互作用Y-GFP+X-HAI3.串联亲和纯化（Tandem Affinity Purification，TAP）a. One-step affinity purificationb. Two-step affinity purification (tandem affinity purification)Affinity purification (immunopurification)融合了标准生化纯化和免疫共沉淀策略的极为有效的快速纯化蛋白质复合物的方法3.串联亲和纯化（Tandem Affinity Purif串联亲和纯化技术的优势与传统的生化纯化方法相比与免疫

15、共沉淀方法相比使用恒定的标签和标准纯化条件避免了每次都要设计新纯化方案的问题多步骤纯化降低了细胞高丰度蛋白质以及免疫球蛋白的背景污染串联亲和纯化技术的优势与传统的生化纯化方法相比与免疫共沉淀方双亲和标签： ProA（葡萄球菌蛋白A 的两个免疫球蛋白IgG结合单位） CBP（钙调蛋白结合肽）实验设计思路双亲和标签： ProA（葡萄球菌蛋白A 的两个免疫球蛋白Ig实验流程钙调素结合肽TEV酶切位点在Ca2+ 离子下结合TEV 酶切用EGTA 洗脱靶蛋白结合于IgG珠子充分洗涤后，在TEV蛋白酶作用下洗脱结合物钙离子存在下，将首次洗脱物中的蛋白质结合于钙调蛋白包被的珠子上充分洗涤后，加入EGTA洗脱

16、结合物实验流程钙调素结合肽TEV酶切位点在Ca2+ 离子下结合TE4. 酵母双杂交（ yeast two-hybrid system ）基于在转录水平上的直接在酵母细胞内检测蛋白质之间相互作用的遗传学方法4. 酵母双杂交（ yeast two-hybrid sys基本原理： 基于对真核生物调控转录起始过程的认识。 前者可识别DNA上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用， 启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活

17、报道基因的表达探测蛋白蛋白的相互作用。 典型的真核生长转录因子， 如GAL4都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域（DNA-binding domain，BD）和转录激活结构域（transcription-activating domain，AD）。基本原理： 基于对真核生物调控转录起始过程的认识。 前酵母双杂交（ yeast two-hybrid system ）三个基本组成部分表达诱饵蛋白的载体，诱饵即我们感兴趣的蛋白，它和DNA结合结构域融合。2. 表达靶蛋白的载体，靶蛋白可以是一个已知的蛋白，也可以是cDNA或基因组文库编码的蛋白。靶蛋白和转录激活结构域融合。3. 一个或多个报告基因

18、（如控制氨基酸合成的基因、大肠杆菌的lacZ基因等），位于DNA结合结构域识别的调控区的下游。 ADDBDgene+reporterMeasurableproduct+DBDbaitADpreyDBDAD酵母双杂交（ yeast two-hybrid system实验设计思路Target:未知蛋白或将研究對象+ DNA binding domainBait:已知蛋白+ activation domainTarget 与Bait可互换转入同一个酵母菌中Construct target plasmid and bait plasmidTransformationScreeningDNA extra

19、ctionDNA sequencing实验设计思路Target:Bait:Target 与BaitYeast Two-Hybrid Assaynucleushis- leu- trp-MeasurableproductDBDbaittrpADfishleureporterDBDADhisHISlacZYeast Two-Hybrid Assaynucleush优势：酵母双杂交方法的优势及缺陷 采用酵母菌株 敏感度高 蛋白折叠 易于筛选 应用范围广缺陷： 核内作用 假阳性 假阴性 转化率优势：酵母双杂交方法的优势及缺陷 采用酵母菌株缺陷： 核内作酵母双杂交方法的应用高灵敏度地检测蛋白蛋白的相互作

20、用 确定蛋白相互作用的结构域或重要活性位点 寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白 寻找具有药物治疗作用的小分子肽 寻找控制蛋白相互作用的化合物 蛋白相互作用图谱的绘制酵母双杂交方法的应用高灵敏度地检测蛋白蛋白的相互作用 举 例酵母双杂交前准备工作双酶切验证21kb5kb3.5kb2kb1.5kb M 1 M:marker1:pGBKT7-BD-X构建诱饵质粒诱饵蛋白的表达X-BDGal4-BD检测诱饵蛋白是否有毒性1 2 3Western blot1.Yeast2.BD-yeast3.X-BD-yeast酵母生长曲线1.未转化酵母2.BD-酵母3.X-BD-酵母举 例酵母双杂交前准备工作双酶切验证21

21、kb M 1 酵母双杂交结果SD/-Trp/-Leu-Trp/-Leu/-His/-Ade +3-AT （20mM）举 例SD/-Trp/-LeuGal4-BD+Y-ADX-BD+Y-ADGal4-BD+Gal4-ADX-BD+Gal4-AD酵母双杂交结果SD/-Trp/-Leu-Trp/-Leu/- X-半乳糖苷酶蓝白斑显色分析举 例X-BD+Y-ADX-BD+gal4-ADGal4-BD+Y-ADgal4-BD+gal4-AD X-半乳糖苷酶蓝白斑显色分析举 例X-BD+Y-ADX酵母双杂交测序结果酵母双杂交得到的阳性克隆子质粒经过DNA测序，由NCBI数据库的BLAST检索cDNA编码的

22、蛋白质举 例酵母双杂交测序结果酵母双杂交得到的阳性克隆子质粒经过DNA测5.噬菌体展示技术（Phage display）基于将某个蛋白与其遗传信息之间直接联系的筛选方法 噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。 5.噬菌体展示技术（Phage display）基于将某特 点 该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面

23、展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。特 点 该技术的主要特点是将特定分子的基因Used for cloning foreign genes among other applicationsProteins and peptides are fused to the Capsid (surface) of the phageThe combination of the phage and peptide is known as a Fusion Protein实验设计思路Use

24、d for cloning foreign genesphagesFilamentous phages M13FdF1OthersT4phagesFilamentous phages Filamentous phagesInfect many gram-negative bacteriaCircular single stranded DNA genomeAbout 6.4kb.p.Long, flexible tube structureabout 1m long and 6.5nm in diameterReproduced and secreted from infected bacte

25、ria without cell killing or lysis (lysogenic phage)Filamentous phagesInfect many (a) Adenovirus. (b) Rotavirus. (c) Influenza virus (courtesy of George Leser). (d) Vesicular stomatitis virus.(e) Tobacco mosaic virus. (f) Alfalfa mosaic virus. (g) T4 bacteriophage. (h) M13 bacteriophage.M13 噬菌体颗粒结构(a

26、) Adenovirus. M13 噬菌体颗粒结构M13噬菌体的生活史其裂解周期为：1)吸附(adsorption) 2)侵入(entory)3)复制（生物合成biosynthesis）4)成熟(maturation) 5)装配(assembly)6)释放(release)M13噬菌体的生活史其裂解周期为：丝状噬菌体的基因及蛋白结构http:/scielo.br/scielo.php?pid=S1415-47572005000100001&script=sci_arttext pIII (406aa, 58copies) pVIII (50aa, 2700 copies) pVI (112aa

27、, 58copies)丝状噬菌体的基因及蛋白结构http:/scielo.br/载体的插入位点 载体的插入位点 pIII 和pVIII 噬菌体展示系统pIII系统pVIII系统拷贝数少多多肽片段大小大10个氨基酸亲和力高低适用范围常用于展示由cDNA和基因组序列编码的多肽，范围较广展示小肽，范围较窄pIII 和pVIII 噬菌体展示系统pIII系统pVIIIT7噬菌体展示筛选系统测序分析插入序列将噬菌体文库铺在固定的靶蛋白上洗脱未结合的噬菌体加入大肠杆菌，扩增和富集洗脱的噬菌体铺富集文库铺盘分离单个克隆34轮筛选验证实验：结合实验实验流程T7噬菌体展示筛选系统测序分析插入序列将噬菌体文库铺在固

28、定的 优点： A. 高通量的淘选：将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬菌体展示肽库（噬菌体的数量可达1011 PFU），利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来。B. 可用于模拟表位的筛选 ：利用噬菌体展示技术得到模拟表位的报道较多模拟表位同样可诱发与天然表位相似的特异性免疫反应，例如利用乙肝病毒的模拟表位免疫小鼠可诱导产生高滴度的乙肝病毒抗体。C. 易于纯化 重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设备，在

29、一般的实验室条件下就可以完成。 缺点： 首先，目前所建的肽库容量只能达到109，要想构建大片段的肽库很困难。其次，需要解决肽库的多样性问题。第三，少数多肽由于疏水性过强，或由于影响外膜蛋白的折叠而不能展示在噬菌体表面。 噬菌体展示系统的应用及优缺点 优点： 噬菌体展示系统的应用及优缺点6、细胞内蛋白质共定位（cellular co-localization）基于细胞内绿色蛋白示踪技术的蛋白质间相互的研究方法6、细胞内蛋白质共定位（cellular co-locali绿色荧光罗丹明染色重 叠相 差举 例细胞内蛋白质共定位研究两种已知蛋白质时空表达关系绿色荧光罗丹明染色重 叠相 差举 例细胞内蛋白

30、质共定位研究两举 例举 例第三节 生物大分子相互作用分析新技术 第三节 生物大分子相互作用分析新技术 1、荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET）能够对于细胞中的蛋白质间相互作用或对作用进行实时原位分析的检测方法供体荧光素 受体荧光素1、荧光共振能量转移技术（fluorescence resoFRET现象 Binding NO BindingFRET: The Size 当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自

31、身的荧光强度衰减。FRET 程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为710 nm 时即可发生FRET；随着距离延长，FRET呈显著减弱.FRET现象 Binding NO BindingFRE实验设计InteractionXCFPYYFPUV laserFRETYellow light emissionYYFPXCFPUV laserCyan light emissionDonorAcceptor实验设计InteractionXCFPYYFPUV laseFRET的能量供体和受体满足条件： 供体受体的激发光谱要分得足够开； 供体的发射光谱与受体的激发光谱要重叠； 供受体的发射光谱要足够分开

32、。FRET的能量供体和受体满足条件： 供体受体的激发光谱要分得CFPYFPWavelength (nm)Normalized intensity (%)GFP 绿 色 荧 光 蛋 白CFP (青色荧光蛋白)(第66位TyrTrp)(第203位ThrTyr)YFP (黄色荧光蛋白)CFP (433nm /476nm) YFP (513nm / 527nm)FRET的能量供体和受体CFPYFPWavelength (nm)Normalize 均相检测（无分离和洗涤步骤） 实时连续地观察活细胞的动态变化FRET技术的优势Fluorescence IntensityTime LigandCy3Cy5

33、均相检测（无分离和洗涤步骤）FRET技术的优势FluoreABCIntermolecularDirectIndirectKinaseStep2Step1FRET应用的类型ABCIntermolecularDirectIndirec生物大分子相互作用分析技术(基础医学与医学实验技术)课件FRET应用范围 酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的复证 蛋白质核酸相互作用 酶活性分析蛋白酶、磷酸激酶 钙流检测、离子通道研究 蛋白质的结构研究FRET应用范围 酵母双杂交系统、噬菌体展示系统所筛选克隆的FRET应用的局限性 信噪比经常不佳，通常为1：1 背景主要来自受体被直接激发的信号 检测仪器的灵敏

34、度、分辨率以及计算机影像采集和分析软件的能力FRET应用的局限性2、表面等离子共振技术（surface plasmon resonance，SPR）适合于多种类型分子并且无需借助标记物可以实现对复合物直接实时测定的方法 SPRimagerII 2、表面等离子共振技术（surface plasmon re 基本原理：基于表面等离子共振（SPR）技术来实时跟踪生物分子间的相互作用，而不用任何标记物。实验时先将一种生物分子固定在传感器芯片表面，将与之相互作用的分子溶于溶液流过芯片表面。检测器能跟踪检测溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化。 基本原理：基于表面等离子共振（SPR）技术来

35、SPR 现象SPR angle450 gold layerp-PolarizedLight 表面等离子共振（SPR）是一种物理现象，当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面（比如玻璃表面的金或银镀层）时，可引起金属自由电子的共振，由于电子吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为SPR角。SPR随表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号。 SPR 现象SPR angle450 gold layeSPR 角度扫描曲线

36、SPR angleSPR 角度扫描曲线SPR angle传统检测原理SPR angle shift as basis of measurement传统检测原理SPR angle shift as basisSPR imaging 检测原理Fixed angle, fixed wavelengthD%RReflectivity change as basis of measurementSPR imaging 检测原理Fixed angle, SPRimager 系统Rotating Stage流动相（含待分析物）Gold-coated glassSPRchipp-pol light棱镜分子探针

37、阵列SPRimager 系统Rotating Stage流动相（GWCs “SPR Imaging” 技术GWCs “SPR Imaging” 技术Bioarray TerminologySPRchipglassgoldattachment chemistryBiosensorAnalyteProbeBioarray TerminologySPRchipglMonitoring Changes: Difference Images=SA+Bim-PEGn-PEGSASAProbe ArrayProbe Array + BiotinT7Difference Image: signal due to binding of BiotinT7 to StreptavidinABAB-Monitoring Changes: DifferencMonitoring Changes: Image + ChartMonitoring Changes: Image + CValue of Real-Time MonitoringProtein Array,End of ExperimentAg SA ConAdd Biotinylated AntibodyD%RminEnd-point m