刚果红法定量检测酵母β-葡聚糖的方法研究

1、PAGE PAGE - 12 -刚果红法定量检测酵母-葡聚糖的方法研究酵母细胞壁来源的-葡聚糖(yeast-glucan,Y-Glu)分为碱溶性和碱不溶性，碱不溶性酵母-葡聚糖具有抗肿瘤1、抗氧化2、改善肠道菌群3、提高人体免疫力等作用，在疾病的预防、治疗方面有着潜在的应用价值。酵母-葡聚糖也是一种大分子物质，具有-1,3键构成的主链，以及-1,6键形成的分支，并具有独特的三螺旋空间结构4，不溶于水、酸、碱。刚果红(Congored，CR)是一种阴离子偶氮染料，棕红色、粉状，易溶于水，具有联苯偶氮结构，能与酵母-葡聚糖三螺旋结构发生特异性结合5。有研究表明，酵母-葡聚糖中每1个3链6螺旋片段中

2、可容纳1分子的刚果红，两者之间可通过氢键和疏水键结合，形成稳定的红色复合物6-7，并使复合物在可见光区的最大吸收波长发生红移8-9。根据此性质可定量检测酵母-葡聚糖的含量。酵母-葡聚糖检测方法有苯酚-硫酸法10、酶法11等，这些方法都是将多糖分解成葡萄糖分子，然后再换算为-葡聚糖，忽略了其他多糖杂质的影响，检测结果特异性不好，误差偏大，在工业生产应用中具有一定的局限性。NITSCHKE等9建立了刚果红试剂用于检测具有-1,3-1,6结构的可溶性蘑菇多糖的方法，为具有相似结构的酵母-葡聚糖的检测提供了借鉴，但酵母-葡聚糖的不溶性，却妨碍了该方法的直接应用。王志等12利用二甲亚砜(dimethyl

3、sulfoxide，DMSO)作为酵母-葡聚糖的助溶剂，实现了酵母-葡聚糖溶解，刚果红试剂得以用于酵母-葡聚糖检测，并建立了相应的检测体系。但是该方法没有对检测的特异性进行研究，不能排除酵母细胞壁中碱溶性-1,3葡聚糖的干扰，该文报道的可完全溶解-葡聚糖的最低DMSO浓度，也与我们的研究结果有较大差异。此外缓冲液的选择、检测限等也没有明确说明，影响了其实验的重现性。所以在此基础之上，对刚果红与酵母-葡聚糖的反应体系进行进一步的优化，明确检测限以确定适用范围，增设干扰物实验确定检测的特异性，完善刚果红试剂-酵母-葡聚糖的检测方法，以期对酵母-葡聚糖的相关研究提供参考。1材料与方法1.1主要材料1

4、.1.1主要试剂酵母-葡聚糖、甘露聚糖，Sigma公司，酵母碱溶性-1,3葡聚糖，Macklin公司；刚果红，合肥博美生物科技公司；NaH2PO4、Na2HPO4、柠檬酸、柠檬酸三钠、醋酸、醋酸钠、二甲基亚砜(DMSO)，天津市科密欧化学试剂有限公司。质量分数为0.01%刚果红溶液(用pH7.5的0.1mol/LNaH2PO4-Na2HPO4缓冲液溶解)。酵母-葡聚糖备用液：准确称量50mg酵母-葡聚糖，加入10mL体积分数为90%的DMSO溶液，于70的水浴锅中加热3h助溶，即得。1.1.2仪器与设备UV-1750型紫外-可见分光光度计，岛津实验器材有限公司；HH-1J型水浴锅，常州国旺仪器

5、制造有限公司；PHS-2F型酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司。1.2实验方法1.2.1反应体系总反应体系为4mL，先加入拟定量的酵母-葡聚糖溶液，再用磷酸盐缓冲液补足至2mL，最后加入2mL刚果红试剂，以不加酵母-葡聚糖的情况为对照，测定吸光度值。1.2.2检测波长与吸收差谱测定将酵母-葡聚糖备用液用蒸馏水稀释至终质量浓度为200g/mL，取1mL于试管中，加磷酸盐缓冲液1mL，再加2mL刚果红试剂；以不加酵母-葡聚糖的情况为对照，进行全波段光谱扫描。1.2.3反应条件的优化1.2.3.1最适pH对反应的影响考察pH为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓

6、冲液对反应体系的影响，反应体系参照1.2.1，其中酵母-葡聚糖的加入量为200g；在25下反应15min，测定540nm下的吸光度值。1.2.3.2最适温度对反应的影响考察不同温度对反应的影响，设定反应温度为20、30、40、50、60，反应体系参照1.2.1，其中酵母-葡聚糖的加入量为200g；在pH为7.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液中反应15min，测定540nm下的吸光度值。1.2.3.3最适时间对反应的影响反应体系参照1.2.1，其中酵母-葡聚糖的加入量为200g；在pH为7.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液中反应，反应温度为25，考察不同反应时间对实验结果的影响，

7、选取反应时间为5、10、15、20、25min，分别测定540nm下的吸光度值。1.2.4缓冲液种类对反应的影响对比pH7.5的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、C6H8O7H2O-C6H5Na3O72H2O缓冲液、CH3COOH-CH3COONa3H2O缓冲液对反应体系的影响，反应体系参照1.2.1，其中酵母-葡聚糖的加入量为200g，通过全波段光谱扫描确定缓冲液种类对反应的影响。1.2.5DMSO对酵母-葡聚糖溶解的影响准确称取酵母-葡聚糖10mg，加入10mL不同体积分数(选择为40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)的DMSO溶液，在70水浴锅中处理3h，根据酵母

8、-葡聚糖与刚果红的反应结果考察酵母-葡聚糖在DMSO中的溶解情况。1.2.6刚果红的检测限测定最低检测限：将酵母-葡聚糖备用液用蒸馏水稀释至终质量浓度20g/mL，反应体系参照1.2.1，在试管中分别加入0、2、4、6、8、10、12g的酵母-葡聚糖，测定540nm下的吸光度值。最大检测限：将酵母-葡聚糖备用液用蒸馏水稀释至终质量浓度1mg/mL，反应体系参照1.2.1，在试管中分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mg的酵母-葡聚糖，测定540nm下的吸光度值。1.2.7酵母-葡聚糖的标准曲线将酵母-葡聚糖用蒸馏水稀释至终质量浓度200g/

9、mL，按照表1加样，考察不同酵母-葡聚糖浓度与吸光度的对应关系。表1刚果红法染色酵母-葡聚糖实验组单位：mLTable1Congoredstainingyeast-glucanexperimentalgroup1.2.8精密度实验将酵母-葡聚糖备用液配制质量浓度为200g/mL。反应体系参照1.2.1，分别在5组试管中加入酵母-葡聚糖160g，测定吸光度。代入标准方程，计算相对标准偏差(relativestandarddeviation，RSD)。1.2.9回收率实验配制质量浓度为200g/mL的酵母-葡聚糖备用液。反应体系参照1.2.1。每次加入酵母-葡聚糖的量为200g，测定5次。计算回收

10、率和RSD。1.2.10干扰物实验以200g/mL酵母-葡聚糖为对照品，配制200g/mL碱溶性-1,3葡聚糖和甘露聚糖为干扰物，将干扰物加入反应体系，测定吸光度3次并取平均值，以评价干扰效果和检测方法准确性。2结果与分析2.1吸收波长和吸收差谱的确定将酵母-葡聚糖和刚果红反应的复合物进行全波段光谱扫描，以不加酵母-葡聚糖的情况为对照，如图1所示。a-吸收波谱；b-吸收差谱图1反应复合物的全波段光谱扫描Fig.1Full-bandspectralscanningofthereactioncomplex在刚果红体系中加入酵母-葡聚糖后吸收光谱发生了红移现象。由吸收差谱可得最大检测吸收波长为540

11、nm，故此后反应体系均采用540nm作为测定波长。2.2不同因素对反应的影响2.2.1pH对反应的影响刚果红是一种酸碱指示剂，其pH变色范围为3.55.2，与-葡聚糖反应时应在刚果红的非变色范围内进行测定，反应pH与吸光度的关系如图2-a所示：在pH6.58.5内，检测结果差异不大，F=2.455，P=0.1140.05，pH条件为反应的非显著性因素。因pH7.5时吸光度值最大，故选择缓冲液pH为7.5。2.2.2温度对反应的影响在不同温度下(2060)反应，测定吸光度，测定结果如图2-b所示，在2030时吸光度变化较为平缓，之后吸光度随着温度的升高迅速下降。温度升高时，可能会引起1,3-葡聚

12、糖链发生构象变化，导致其结合位点容纳的刚果红分子的数量减少13，故实验选择20为反应温度。2.2.3时间对反应的影响时间与吸光度的关系如图2-c所示，随着反应时间增长，反应的吸光度逐渐升高后趋于平缓。当反应时间为15min时，吸光度达到最大值为0.231，故选择反应时间为15min。-葡聚糖与刚果红结合后的吸收光谱是平衡时游离染料和复合物的吸收光谱之和，这是一个动态可逆反应过程，随着时间的变化，其反应会逐渐趋于平衡14。a-pH；b-温度；c-时间图2不同因素对反应的影响Fig.2Theinfluenceofdifferentfactorsonthereaction2.3不同种类缓冲液的选择结

13、果在540nm处，吸光度值由上至下依次为，磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、刚果红对照液。如图3所示。图3不同缓冲液对吸光度的影响Fig.3Theinfluenceofdifferentbuffersonabsorbance实验结果显示，盐溶液可能会导致-葡聚糖无序的空间结构向有序转变，而有序的能更好地与刚果红结合14。而在磷酸缓冲液中酵母-葡聚糖与刚果红结合更为灵敏，其结合度要高于其他几种缓冲液。2.4不同体积分数DMSO处理酵母-葡聚糖的结果分析用不同体积分数的DMSO处理酵母-葡聚糖，其浓度与吸光度的关系如图4所示。随着DMSO体积分数增加，溶解的酵母-葡聚糖逐渐增多，直接观测法可明

14、显看出从50%90%悬浮物逐渐减少，吸光度与DMSO体积分数接近线性关系，说明此浓度范围的DMSO溶液对酵母-葡聚糖的空间结构没有破坏或破坏程度极小；在90%100%时，溶液呈澄清透明状，说明酵母-葡聚糖被完全溶解，但吸光度有所降低，可能与酵母-葡聚糖结构被破坏有关。本实验结果与其他文献报道15的DMSO能破坏酵母-葡聚糖结构说法有所不同，可能是实验所使用的酵母-葡聚糖的分子质量不同所致，其具体原因有待进一步探究。图4不同含量DMSO与吸光度的关系Fig.4RelationshipbetweendifferentDMSOandabsorbance2.5刚果红检测限结果分析对酵母-葡聚糖的最大检

15、测限和最小检测限进行了实验分析，酵母-葡聚糖的含量与吸光度关系如图5所示。酵母-葡聚糖的含量为04g时，其颜色反应不足于检测出来；当含量大于4g，吸光度随着含量增加而接近线性关系。当含量达到1600g时，吸光度逐渐趋于平稳，其中线性较好的范围是4200g。2mL的0.1mg/mL刚果红试液即为0.2mg，可与41600g内酵母-葡聚糖的发生反应。说明酵母-葡聚糖的三螺旋结构片段与刚果红分子结合有上限，并不是无限结合，其结合度与氢键和疏水键有关。图5刚果红检测限Fig.5LimitofdetectionofCongored2.6标准曲线按照1.2.7步骤进行实验，通过OriginPro8.5软件

16、拟合回归方程，酵母-葡聚糖在4200g内有良好的线性关系，回归方程为：Y=0.00115X-0.00114，R2=0.9986。2.7精密度实验结果对同一批样品进行重复实验，对该方法进行精密度验证。分别在5组试管中加入相同量的酵母-葡聚糖，测定吸光度，结果见表2，实验结果RSD为1.154%，表明检测方法重复性良好，可作为酵母-葡聚糖检测方法使用。表2精密度实验结果Table2Precisiontestresults2.8回收率实验结果在酵母-葡聚糖样品中加入不同量的标准品，测定回收率，实验结果如表3所示，其平均回收率为100.32%，RSD为1.11%。准确度高，可满足一般检测的需要。表3回

17、收实验结果Table3Experimentalresultsofsamplingrecovery2.9干扰物实验结果以酵母-葡聚糖为对照组，在干扰组中分别加入-1,3葡聚糖和甘露聚糖，测定干扰率，实验结果如表4所示。表4干扰物实验结果Table4Experimentalresultsofinterference结果显示，-1,3葡聚糖干扰率(0.587%)精密度(RSD=1.154%)，说明-1,3葡聚糖对检测的结果影响较小；而甘露聚糖对反应有较大的影响，但是在实际样品的检测中，经过预处理后的甘露聚糖已经被去除，并不影响测定结果。3讨论与结论实验利用刚果红与酵母-葡聚糖特异性结合的性质，对酵母

18、-葡聚糖进行定量检测，避免了传统检测方法间接、多步测定和误差偏大的缺点，显示出一定的优越性。对刚果红和酵母-葡聚糖的反应体系和反应条件进行优化，结果显示，0.1mol/L，pH7.5磷酸缓冲液使反应灵敏度提高，最低检出限提高为4g；温度影响刚果红和酵母-葡聚糖两者的结合度，在20下，结合度最大。15min时，反应可以达到平衡。在此优化条件下进行验证实验。精密度RSD为1.160%，平均回收率为100.32%，相比优化前具有更好的精密度和更高的回收率，测定结果准确、稳定；干扰性实验显示，反应不受碱溶性-1,3葡聚糖的干扰，而受甘露聚糖影响较大。酵母-葡聚糖为不溶性物质，经过预处理以及中间的制备过程，可溶性的甘露聚糖几乎被完全去除，几乎无法检出。因此