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文档简介

1、【目的】：了解底物浓度与酶反应速度间的关系，学习求蔗糖酶米氏常数的方法【原理】：米氏方程式 v = 米氏常数的求法很多，最常用的是LineweaverBurk的作图法(双倒数作图法)。米氏方程式可改写为下列倒数形式：选择不同的s，测定相应的v，求出两者的倒数，以1/s为横坐标，以1/v为纵坐标作图，绘出一条直线，外推至横轴相交，横轴截距即为-1/Km。 蔗糖酶米氏常数的测定 VmaxSKm +SS1/2VMAXvVMAXKm底物浓度与反应速度关系曲线 VmaxS V= Km + S 还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应：【仪器与试剂】1. 仪器：分光光度计、恒温水浴、试管、吸管、秒表

2、、坐标纸2试剂标准葡萄糖溶液（1 mg/mL）3%蔗糖溶液（87.7 mM）0.2 mol/L NaAc缓冲溶液（pH4.6）0.5 mol/L NaOH溶液3,5-二硝基水杨酸试剂【操作步骤】 1葡萄糖标准曲线的制定管号012345葡萄糖标准液(mL) 00.20.40.60.81.0蒸馏水(mL)2.01.81.61.41.21.03,5-二硝基水杨酸试剂(mL)3.03.03.03.03.03.0将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用冷水冷却至室温，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀。测540nm处A值。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A值为纵坐标作出标准曲线。取试管8支编号，

3、按下表将蔗糖溶液，醋酸缓冲液分别加入试管，于37水浴中保温10min。一定量酶液同一水浴中保温约10min。于各管中依次按同样间隔(0.5min)加入已保温过的酶液1.0mL，计时，立即摇匀，在37中准确温浴5min。按同样次序和时间间隔，加入1mL 0.5mol/L NaOH，摇匀，终止反应。吸取反应物1.0mL，加入盛有3.0mL 3，5-二硝基水杨酸试剂和1.0mL水的试管中混匀，放入沸水浴中加热5min，冷却后稀释至25mL，摇匀，在540nm比色测定A值。以A值对应的葡萄糖量为相对反应速度，以1/S为横坐标，1/v为纵坐标作图，由图求出Km值。2底物浓度和初速度测定反应物终止反应活力测定数据处理管号3%蔗糖液(mL)醋酸缓冲液(mL)酶液(mL)1molLNaOH(mL)吸取反应物(mL)水杨酸试剂(mL)水(mL)A540底物浓度1/s1/1234567800.51.01.52.02.53.755.05.04.54.03.53.02.52501.01.01.01.001.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0

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