双波长差吸光度法后分光技术应用和发展前景

1、双波长差吸光度法及后分光技术的应用和发展远景(精)双波长差吸光度法及后分光技术的应用和发展远景(精)9/9双波长差吸光度法及后分光技术的应用和发展远景(精)双波长差吸光度法及后分光技术的应用和发展远景李雪志(本文1996年宣布成立在Lambertbeer定律基础上的单波长分光光度分析技术,应用极为广泛,但因为单波长法存在污浊试样对光的散射和比色杯背景汲取等难以战胜的弊端,它在高精度丈量中的应用遇到必然的限制。为认识决污浊试样对分光光度测定的干扰问题,美国的B.Chance于1951年制成了用振动镜使两束不同样波长的单色光交替经过待测溶液的双波长分光光度计(DoubleWavelengthSpe

2、ctrophotometer从,而确立了双波长分光光度法的基础。跟着科学技术的发展,双波长分光光度分析技术已日臻圆满,与先进的后分光技术相联合,在生化自动化分析中获取了广泛的应用并显示出了光明的发展远景。双波长分光光度法的原理双波长分光光度法是在传统分光光度法的基础上发展起来的,它的理论基础是差吸光度和等汲取波长。它与传统分光光度法的不同样之处,在于它采纳了两个不同样的波长即丈量波长(又叫主波长p,PrimaryWavelength和参比波长(又叫次波长s,SecondWavelength同时测定一个样品溶液1,2,以战胜单波长测定的弊端,提升了测定结果的精巧度和正确度。初期的双波长分光光度计

3、在测准时,两束不同样波长的单色光经斩光器(Chopper,一种用于双波长分光光度计中使光束按必然周期反射,遮断或经过的装置办理后,以必然的时间间隔交替照耀1比色杯,经待测溶液汲取后,再照到光电管上,产生两个不同样的吸光度,再将这两个吸光度相减,就获取了差吸光度A。依据Lamber-Beer定律,得:Ap=pLC+Ap(1As=sLC+As(2式中:A、pAs分别为待测溶液在主波长和次波优点的吸光度、p分s别为待测溶液在主波长和次波优点的摩尔吸光系数:光径:待测溶液的浓度Ap、As:分别为待测溶液在主波长和次波优点的散射或背景汲取当p、s相差不太大时,由同一待测溶液产生的光散射吸光度和背景吸光度

4、大概相等,即Ap=As,将(1式-(2式得:A-pAs=A=(-psLC(3关于同一待测溶液来说,-p是s一常数K,在光径L不变的状况下,(3式可简化为:A=KC(4(4式说明,待测溶液在p与s两个波优点测定的差吸光度A与试样中待测物质的浓度C成正比。这就是双波长法赖以成立的定量公式1,3。双波长差吸光度法拥有能够战胜溶液污浊的影响、共存组分汲取谱线叠加的搅乱,以及减少比色杯的光学不均一等优点。它的差吸光度在2.5之内时,线性范围优秀。2选择双波长的方法1,3双波长差吸光度只管有好多优点,但是怎样正确选择双波长,则是应用的重点。选择双波长常用的方法有三种:2.1依据待测溶液对吸光谱的汲取曲线,

5、选择最大汲取峰对应的波长为p吸,收曲线下端较为平坦的某一波长为s。2.2选待测溶液嗫大汲取峰对应的波长为p选,等汲取点的长为s。所谓等汲取点,是指关于某个波长,只管待测溶液的浓度不同样,但对该波长的光的汲取均相等。等汲取点所对应的波长叫做等汲取波长。关于汲取光谱拥有汲取峰的物质,同浓度下吸光度相等的两个波长,也是等汲取波长。等汲取波长是双波长法的理论基础之一。应用这一方法的必需条件是能正确地测定出等汲取点,不然将造成明显的偏差。2.3选溶液最大汲取峰的波长为p,选显色剂的最大汲取峰对应的波长为s。该法又称为双波长增敏法,它的原理是:当向必然浓度的显色剂溶液中加入待测物时,因为生成物质浓度的增大

6、,生成物的吸光度也随之增大,而显色剂则因为不停耗费,其吸光度渐渐减小。假如以p为测定波长,s为参比波长时,测得的差汲取光度明显是生成物吸光度与耗费的显色剂的吸光度之和,进而提升了测定的敏捷度。由上述方法能够看出,双波长法选择主波长的原理与单波长法同样:均选择待测溶液最大汲取峰对应的波长,所不同样的是双波长法还应依据不同样条件选择次波长。文件指出1,影响双波长法测定精巧度的要素是:光辐射噪声,电源不稳和读出噪声,采纳强光源能够改良测定的精巧度。当试样中含有搅乱物质时,因为双波长法减少了样品的形式偏差,故测定的精巧度优于单波长法。影响双波长法正确度的要素是:由化学搅乱物惹起的偏差,但这类偏差要比单

7、波长法小得多;由物理搅乱惹起的偏差,但能够经过采纳较小的双波长差等方法来减少偏差,并且这类偏差自己就比单波长法更小;由仪器的非理想性如比色杯的性质和地点,以及信号失调、狭缝过大和杂散光等惹起的偏差,此中尤此后者惹起的偏差为大,所以要求仪器的波长精度在高并且尽量减少杂散光。后分光技术及其在仪器上的应用现代的全自动化分析仪因为多项目同时进行测定的需要,对分光光度计作了革命性的改造,并产生了后分光技术的见解,进而使双波长分光光计光学系统的构造变得较为简单并且与单波长分光光度计有很大的差别。所谓后分光技术是相对传统的分光光度计而言的。尽人皆知,光电比色法赖以成立的Lambert-Beer定律只适用于单

8、色光,单色光纯度越高则测定结果的精巧度和正确度越好,假如用混淆光比色,则溶液的吸光度与液层厚度和溶液浓度间不可以比率关系。所以,传统的分光光度计是以单色器(棱镜或光栅对入射光进行分光,此后使特定波长的单色光经过待测溶液进行比色测定,而现代生化分析仪上采纳所谓后分光技术的分光光度计则是直接以光源灯所发出的混淆光透过待测溶液,经溶液汲取后再用全息光栅(HolographicGrating,是当前最高等的分光器件,它既能够简化光路,又能够减少杂散光,由它色散后投射到二极管矩阵上的光谱焦平面的波长精度在2nm之内6对出射光进行分光,此后将纯度很高的不同样波长的单色光折射到光电二极管矩阵(Photodi

9、odeArray上,因为地点不同样,矩阵上的每一个光电二极管只好接收某个特定波长的单色光。有人据此以为这各种类的分析仪但是用某几个波长的滤光板,光不纯,波长精度差,其实这是一种误会。这类仪器在编制程序时(厂家或用户已开初设定好某项试验采纳某个波长,仪器工作时在微机的控制下只接收所选波长的光电管上产生的电信号并将其转变为相应的吸光度。当前的大部分生化分析仪的二极管矩阵都有7到10个光电二极管,包括了从340nm700nm范围内常用的710个测定波长4,5,有的分析仪(如美国雅培企业的EPX、SPECTRUM、CCX系列甚至多达16个波长。因为现代生化分析仪采纳凹面全息光栅为后分光器件,进而撤消了

10、斩光器。使双波长分光光度计的构造变得相对简单,并且更加重点的是,采纳这类构造的后分光技术使生化分析仪上多顶目同时测定变为现实。不然,假如仍按传统分光光度计同样以单色光进行比色测定,为适应不同样顶目在短时间内用不同样波长比色的需要,分光器件必然在几秒甚至更短的时间内屡次地改动反射镜的地点,这关于机械来说是难以办到的,即便制成也会易于破坏而缺少适用价值。后分光技术的成立使上述问题水到渠成,并且使双波长分光光度法变得更加适用。双波长法及后分光技术的现状和远景双波长法自成立到现在已有四十多年的历史,各样通用型双波长分光光度计在外国应用已相当广泛,但国产的分光光度计仍以单波长法为主。国内有人依据双波长法

11、的基本源理,敷衍了事,利用一般的单波长分光光度计(如721型成立双波长测定法,即先用某一波长比色,记录吸光度,再用另一波长比色后记录另一吸光度,此后按双波长法进行计算,获取了较满意的结果。最近几年来,应用双波长法并联合后分光技术的全自动生化分析仪已大批引进到国内,但除了厂家供给的双波长数据外,好多人在仪器上自行编制试验程序时对次波长选择的重要性常常认识不足,拥有较大的任意性,由此造成试验结果偏差还不知原由所在,所以有必需增强对双波长法和后分光技术的认识。但能够预示,跟着外国先进仪器的引进以及国产双波长分光光度计渐渐进入市场,这一新技术必然为愈来愈多的人所认识和接受,并在医学查验领域获取广泛的应用。参照文件王叔仁,等。双波长分光光度法.济南:山东科学技术第一版,1986.叶应妩,等主编.临床实验诊疗学(上.北京:人民卫生第一版社,1989:137.黄尊波,等.双波长分光光度法在医学查验上的应用.中华医学查验杂志,1981,4(3:185.ServiceReferenceManualof550Ex