基因工程方法生产乙肝疫苗

1、 工 生 疫 ( 3 )-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company -CAL-本仅作为文档封面，使用请直接删除重组乙肝疫苗的研制生产过程、理化性质、生物学活性、临床应用国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫 苗。第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病 毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。 是由于 对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗，也就 是基因重组疫苗。第一步是分离目的基因，获得目的 DNA 片段的方法主要有两 种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合成。第二步是将 片段和载体在体外

2、连接重组，成为重组 分子， 多采用连接酶的方法连接。第三步是基因克隆，即将重组体 DNA 分子，引进合适的宿主细胞(大 肠杆菌、酵母)中增殖。根据所用载体的不同，可选用转化以质粒作载体 时，重组体 DNA 分子以此种方式进入感受态的宿主细胞，以获得转化子菌 落)、转染( 噬菌体作载体时，构成的重组体 分子，以此种方式进入宿 主细胞，可转染得到噬菌斑)、转导( 噬菌体 DNA 与外源 DNA 组成的重组体 DNA 分子，与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒，即人工包装的噬 菌体颗粒，引入宿主细胞)的方法，往宿主细胞引入重组体 DNA 分子。第四步是目的基因克隆的筛选与鉴定，即从大量携带重组体

3、 DNA 分 子的细胞中分离出带目的基因的细胞。因为不是所有的细胞都能获得重组体 DNA 分子，为了获得摄取了重组体 分子细胞，需经筛选，才能将其与未 摄取重组体 DNA 分子的细胞区别开来，并作进一步鉴定。筛选含有重组体 DNA 分子细胞的方法，一般都是以载体 及目的基因的遗传标记及分子特 征为依据，并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。由于许多质粒都具有 抗生素等药物的抗性标记，因此，在含有一定浓度抗生素的选择培养基上， 可以很容易地把摄取了重组体 分子，因同时也获得了抗生素抗性的细胞 辨认出来。但药物筛选只是一个方面，依据它只能判断质粒载体是否进入了 受体细胞，还不能确定受体细胞是否摄取

4、了含有目的基因的重组体 分 子。对于重组体 分子的鉴别，通常是在抽提出重组质粒 后，用 凝胶电泳法或电镜观察其分子大小，用限制酶酶解，观察其酶切图谱进行。 还可采用菌落原位杂交法来进行鉴定，即将菌落从最初生长的平板上转移到 硝酸纤维素滤膜上，用碱裂解滤膜上的菌落，使 分子游离，变性，并固 定在滤膜上，随即用同位素标记的与目的基因互补的 或 RNA 探针杂交， 最后通过滤膜的放射自显影鉴定菌落，并从最初生长的平皿上挑选出放射自 显影呈阳性的菌落。第五步是基因表达，这是指宿主细胞在大量繁殖过程中外源 DNA 在 宿主细胞中的转录和翻译，表达生成的产物(蛋白质)，最好在细胞内不被分 解，而分泌到细胞

5、外面。表达产物若为较小的多肽，或是对细菌蛋白酶极为 敏感的蛋白质，形成后，通常即被迅速降解。为了保证外源基因表达产物能 分泌到细胞外而不被降解，通常可以把外源基因插入在载体的某些结构基因 中间，在这种情况下，表达产物是融合蛋白质，融合蛋白质可以抵抗内源蛋 白酶的降解，又可以在细胞信号肽的引导下分泌到细胞外。最后，利用发酵工程培养重组与乙肝疫苗的工程菌理化性质从热稳定性方面说酵母源乙型肝炎疫苗37保存1周不改变其免疫原性乙肝疫苗，主要成分是45个氨基酸的多肽，通过化学合成的方式制备， 使用直接注射的方法打入静脉。这5个氨基酸分别编码了三个抗原表位（所 谓表位，是一串大于9个氨基酸的多肽，是能够刺

6、激免疫系统发生反应的最小 多肽片段）：,HBscFv 等电点理论值为 1,实验值为 （就是抗体）综上所述，用基因工程法生产乙肝疫苗要先后将过获取目的基因、构建 重组质粒、构建基因工程菌、培养工程菌、乙肝病毒表面抗原的分离纯化、 产品多项性质的初步检测、成品化处理（如添加佐剂、抗生素、除菌）、成 品检测鉴定、包装几个步骤。对产品多项性质的检测对于保证疫苗的安全性 尤其重要。目 床上应用的 肝疫苗主要有以下几种： ) 源性乙肝疫苗： 此疫苗是用无症状的 HBsAg 携带者的血液制 成，故称血源性乙肝疫苗。它的制备步骤大致是：采用高滴度 HBsAg 阳 性携带者血液，分离出血浆并除去其中有感染的 H

7、BV 颗粒后，再将 HBsAg 予以浓缩与纯化，充分灭活，以消灭其中可能存在的一切已知病 毒和消除 HBsAg 表面可能存在的全部宿主蛋白，然后添加佐剂及防腐剂 而成。为确保疫苗的安全，每一阶段均取样做无菌试验、热源试验及动 物安全试验等，以检查疫苗中有无其他病原体及血液中的抗原物质。此 种疫苗的免疫原性与安全性均已获得解决。 ) 因工程疫苗 利用基因工程研制重组 DNA 乙肝疫苗，曾先后 研制过大肠杆菌系统、啤酒酵母细胞系统、哺乳动物细胞系统和牛痘病 毒系统的重组乙肝疫苗。目前多用酵母基因的重组疫苗。其具有良好的 免疫原性，免疫应答特点与血源性乙肝疫苗基本相似，且多无严重的不 良反应。(3

8、) 含前 蛋的乙肝疫苗 目前临床上应用的血源性疫苗与 基因工程疫苗，均只含 HBsAg 蛋白，当证实 S 白能增强 HBsAg 的免疫 应答后，又注意到单纯只含 HBsAg 蛋白的疫苗对血液透析病人与新生儿 免疫效果较差时，遂生产出添加前 S 白的酵母源性重组乙肝疫苗，它 确能明显地增强免疫应答。图 1 乙肝病毒表面蛋白表达载体的构建基因工程技术生产乙肝疫苗首先要选择表达 的载体系统。在之前 的研究中发现，若选用细菌为基因表达载体，即使使用强启动子，也不能得 到大量具有免疫原性的基因表达产物。可能是由于原核表达系统中不能进 行糖基化修饰，或者原核细胞环境不适合专性寄生于真核生物的乙肝病毒包 膜蛋白表达，故应选用真核表达系统。选用酵母（ cerevisiae）作为宿主系统，因其具有丰富的膜结构和细胞器的特点，既可 使蛋白以分泌形式表达，又可以使蛋白糖基化变为活性形式。克隆载体构建 时，将编码 HBsAg 的基因