流式细胞术及其应用

1、流式细胞术及其应用第1页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五 第 一 部 分流式细胞术的一般介绍第2页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五概念流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞仪（Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。第3页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五流式细胞仪特点单细胞悬液或

2、生物颗粒 分析速度高多参数精度高当代最先进的细胞定量分析技术第4页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五流式细胞发展史 1930年，Caspersson 和Thorell开始致力于细胞的计数。 1934年，Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪 记录流过一根毛细管的细胞。 1953年，Croslannd-Taylor 应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动数器。 同年，Parker 和Horst 描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形。 1965年，Kamemtsky等提出两个设想，一是用分光光度计定量细胞成分；二是结合测量值对细胞

3、分类。 1967年，Kamentsky 和Melamed 在Moldaven的方法的基础上提出细胞分选的方法。 第5页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五流式细胞发展史 1969年，Van Dilla，Fulwyler及其同事们在Los Alamos，NM（即现在的National Flow Cytometry Resource Labs）发明第一台荧光检测细胞计。 1972年，Herzenberg 研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号。 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS

4、I。从此，大量的厂家不断研制生产出自己的流式细胞仪，流式细胞术进入了一个空前飞速发展的时代。进入九十年代，流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻完善，而随之而来的就是应用领域的日趋广泛。而今，流式细胞仪已经深入到生物学、医学、药物学等的各个分支领域，并将在未来为我们的科学研究发挥更大的作用。第6页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五流式细胞仪及其工作原理第7页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五FACSCalibur特点：光路调节系统固定自动化程度高操作简便使用寿命长配备1-2根激光主要用于细胞分析临床型（台式机）第8页，共56页，2022年，5月20日，1

5、点31分，星期五BD LSR特点：配置三种激光器488/UV/633最多可检测六种荧光和两个侧向参数可与下面FACS Vantage 连用.高效分选细胞第9页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五FACS Vantage DiVa科研型（大型机） BD Biosciences 特点：多数字化适用用各类细胞分选4路分选分选10,000cells/second or more 第10页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五FACSAria科研型特点：分辨率高选配多种波长和类型激光器可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析第11页

6、，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五本校FACSCalibur第12页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五流式细胞仪检测范围细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能第13页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五临床研究 淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、PNH诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价、flow-FISH法测

7、定端粒长度第14页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五基础研究 淋巴细胞功能、树突状细胞(DC)研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究(MDR)、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究第15页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五流式细胞仪的工作原理光学系统 激光光源 光收集系统液流系统 流动室 液流驱动系统电子系统 光电转换 数据处理系统细胞分选系统第16页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五激光光源单波长、高强度、

8、高稳定性多采用氩离子激光器或氦氖激光器一般选配2-4根激光，488nm 、633nm和355nm、407nmUV激光最多检测13个荧光参数 第17页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以633nm较强。免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,则可得到55065

9、0nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。第18页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五Longpass Shortpass Bandpass460 500 540460 500 540460 500 540SP 500LP 500BP500/50光收集系统：滤光片第19页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五 光收集系统：光电倍增管（PMT）荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光一般由光电倍增管（PMT）检测。PMT的响应时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200900nm的光谱区，光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从103

10、到108可连续调节，因此对弱光测量十分有利。第20页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五FACSCalibur 光路图第21页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五液流系统：流动室、液流驱动系统流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。第22页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱为了保证液流是稳液，一般限制液流速度10m/s。由于鞘液的作用，

11、被检测细胞被限制在液流的轴线上。第23页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五细胞分选系统488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector第24页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五细胞分选系统样品分选原理 流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的。总的过程是：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入

12、收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。稳定的小液滴是由流动室上的压电晶体在几十KHz的电信号作用下发生振动而迫使液流均匀断裂而形成的。一般液滴间距约距约数百m。实验经验公式f = v / 4.5 d给出形成稳定水滴的振荡信号频率。其中v是液流速度，d为喷孔直径。使分选的含细胞液滴在静电场中的偏转是由充电电路和偏转板共同完成的。充电电压一般选 150V，或-150V；偏转板间的电位差为数千伏。充电电路中的充电脉冲发生器是由逻辑电路控制的，第25页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五不同分选系统第26页，共56页，2022年，5月20日，1

13、点31分，星期五信号检测 液流中央的单个细胞通过测量区时，受到激光照射后,我们可以接收到两种光信号. 第一种 散射光 受到激光照射会向立体角为2的整个空间散射光线，散射光的波长和入射光的波长相同。散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关. 第二种 荧光 荧光染料在激光的激发下,发荧光可显示出研究对象的相关信息.荧光信号主要包括两部分：自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。

14、第27页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五在流式细胞术测量中，常用的是两种散射方向的散射光测量FSC forward scatter light (“fsc”) or forward angle light scatter (“fals”). 小角散射又称前向角散射光光它反应细胞的相对大小和截面积的大小,一般说来，前向角散射光的强度与细胞的大小有关，对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大；对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系 ；SSC side scatter light (“ssc”) or 90 light scatter. 侧向角散射又

15、称90度角散射光代表细胞的颗粒度和精细结构的变化.FSCSSC荧光Laser第28页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五全血细胞流式FSC-SSC图红细胞白细胞血小板及死细胞单核细胞第29页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五信号检测-荧光信号自发荧光特异荧光特异荧光能量级激发激发态发射激光能量损失第30页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五荧光及发光原理荧光的产生一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原

16、子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。寿命为10-8 10 -11s。由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf 为106109s-1。 第31页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五荧光物质 荧光色素 许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常

17、用的荧光色素有：异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490 495nm，最大发射光波长520 530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，有两种同分异结构，其中异构体型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为

18、595600nm，呈橘红色荧光。第32页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五 其他荧光物质酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-D半乳糖苷受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰

19、变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。第33页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五数据显示类型单参数直方图（Histogram）X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率第34页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五二维等高图和密度图第35页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五Pseudo 3D Plot3D Plot第36页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五 二维点图Dot Plot便于数据统计不同的细胞群可以用不同的颜

20、色标记主要表达方式第37页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五光谱交叉Emission wavelength (nm) 530 580 630 680 730 780FITCPEPE-TRPE-CY54 colors - simultaneous collection两色以上荧光分析存在 光谱交叉第38页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五荧光补偿方法所有补偿调为“0”调节电压，用同型对照或阴性对照，使阴性群位于“左下角”依单阳群体调节荧光补偿第39页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五抗体使用原则根据仪器型号和抗原表达强弱合理选择荧光抗体

21、低表达抗原标记高S/N（信噪比）荧光素，如PE、APC使用双标以上抗体必做荧光补偿第40页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五 样品培养细胞新鲜组织石蜡包埋单细胞 悬液 标记荧光抗体检测表型测定细胞分选流式细胞术操作流程统计学 分析继续培养第41页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五 第 二 部 分 流式细胞术的应用第42页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五 细 胞 周 期 分 析第43页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五样品制备 1000rpm 5分钟收集2X106个细胞PBS漂洗 两次 70%酒精4度固定过夜收集固

22、定的细胞PBS漂洗0.5 PBS悬浮细胞2.5l 10g/l RNase A37度消化1小时过300目细胞筛50l 0.1mg/ml PI（含1%Triton)，1000rpm 5分钟 离心两次混匀，室温静止5分钟上机第44页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五建立获取模式，获取数据 （PI单染分析细胞周期，同时看凋亡）去甲斑蟊素对肝癌细胞周期的作用 第45页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五数据分析圈门去除细胞碎片，分析细胞凋亡圈门去除粘连体，分析细胞周期第46页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五细胞凋亡分析 H2O2诱导成神经瘤细胞

23、的凋亡照片，蓝色为细胞核，绿色是凋亡细胞。 A.K. Stout and J.T. Greenamyre, Emory University 第47页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五细胞凋亡细胞凋亡首先出现的是染色质的浓缩, 导致致密的、分离的、边界清晰的半月形的染色质颗粒集中于核膜边缘;随后染色质浓缩过程伴随有核膜及细胞膜的内陷, 接着核碎裂成分离的片段, 胞浆浓缩, 细胞支架断裂,这些片段被细胞膜包裹; 跟着出现的是凋亡细胞断裂成若干个有完整包膜包裹的凋亡小体(apoptosis body) , 小体的大小及其内容差异甚大, 大部分含有若干核片段, 少数可能没有核片段

24、。第48页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五细胞核染色体局部凝聚细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻染色体局部凝聚引自 第49页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五缺乏IL3诱导的细胞凋亡Michael G. Ormerod Journal of Immunological Methods 265 (2002) 73 80第50页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五Annexin V-PE/7-AAD 双染色法双阴：活细胞 Annexin V-PE单阳：早期凋亡细胞双阳：晚期凋亡细胞 7-AADd单阳：坏死细胞第51页，共56页，2022年，5月20日

25、，1点31分，星期五检测淋巴细胞引起的细胞毒作用细胞毒性淋巴细胞（包括细胞毒性T细胞CTL和自然杀伤细胞NKC）能释放包含穿孔素蛋白和颗粒酶的颗粒或通过Fas-Fas连接作用于靶细胞，引起靶细胞内Caspase酶激增，导致细胞死亡包括凋亡。具有重大研究和应用价值。通常测定淋巴细胞介导的细胞毒性作用，用同位素51Cr，操作复杂危险而且不利于单细胞分析。流式细胞术测定细胞毒作用(FCC)，利用Caspase专一性荧光底物测定受害细胞的细胞毒作用强度。准确简便迅速。第52页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五 The FCC assay provides rapid and sen

26、sitive detection of NK cell cytotoxicity. TFL2-labeled Jurkat cells were incubated with the NK cell line NK92 at an E/T ratio of 51 for the time indicated in the presence of the caspase 6 substrate. Significant cytotoxicity(50%) was detected as early as 20 min.From: Methods in Molecular Biology: Flo

27、w Cytometry Protocols, 2nd ed.Edited by: T. S. Hawley and R. G. Hawley . Humana Press Inc., Totowa, NJ第53页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五 The detection of NK92-mediated killing of breast carcinoma target cell lineMDA-MB-468 cells using both flow cytometry (A,B) and confocal microscopy (C,D).Target cells

28、 were labeled with TFL2 and incubated without (A,C) or with (B,D) NK92cells for 2 h in the presence of caspase 6 substrate. Nonapoptotic target cells are red; apoptotic target cells have both red and green fluorescence signalsand therefore appear yellow.第54页，共56页，2022年，5月20日，1点31分，星期五参考资料部分书籍及杂志：Methods in Molecular Bology : Flow Cytometry ProtocolsEdited by M J Jaroszesk