流式细胞技术和流式细胞仪

1、流式细胞技术和流式细胞仪第1页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四 本章内容提要 概述 第一节 流式细胞仪的工作原理 第二节 流式细胞仪的分类与结构 第三节 流式细胞仪的主要性能指标 第四节 流式细胞仪应用的技术要求 第五节 FCM的维护及常见故障的排除 第六节 流式细胞仪的临床应用 本章内容小结第2页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四概述 流式细胞仪的定义流式细胞术的定义生物学颗粒的内容流式细胞仪的发展史第3页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四概述 流式细胞仪的定义:流式细胞仪是以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测

2、量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。 第4页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四概述 流式细胞术的定义:应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术。 第5页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四概述 生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等，所检测的生物颗粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。第6

3、页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四概述 1934年：Moldavan1967年：Van Dilla 和Los Alamos 1965年：Kamentsky 1969年：Fulwyler利用Sweet 80年代 90年代第7页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四概述 1934年Moldavan 使悬浮的血红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来，这可谓流式细胞仪的最初模型。 第8页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四概述 1965年Kamentsky用紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色的细胞，给出

4、了细胞中核酸的含量和细胞大小，奠定了多参数流式细胞测量的基础。第9页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四概述 1967年Van Dilla 和Los Alamos采用了Crosland-Taylor设计的层流流动室和氩离子激光器开发出了液流束、照明光轴，检测系统三者互相垂直的流式细胞仪，成为目前各种流式细胞测量仪的基础。 第10页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四概述 1969年Fulwyler利用Sweet的静电墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式细胞分选术。Ehrlich和Wheeless利用飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨率

5、的流式细胞仪。 第11页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四概述 80年代以来，流式细胞仪的数据采集、存储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方法的增多，新的荧光染料和细胞标记物的出现，流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。 第12页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四概述 进入90年代，标本制备仪和自动进样器的问世，以及适合临床应用的单克隆抗体的增加，使流式细胞仪不仅出现在大专院校和科研单位，它也逐渐进入医院的中心实验室和检验科。 第13页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第一节 流式细胞仪的工作原理第一节 流式细胞仪的工作原理 一、生物学

6、颗粒分析原理 二、细胞分选原理第14页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第一节 流式细胞仪的工作原理1.样品的进入流动室：将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放人样品管。在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动。第15页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第一节 流式细胞仪的工作原理2.鞘液的作用：流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直相交，相交点称为测量区。 第16页，共7

7、4页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第一节 流式细胞仪的工作原理3.信号的产生与接收：染色的细胞在测量区受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被光电倍增管和光电二极管接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得细胞的大小和核酸含量等指标。第17页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第一节 流式细胞仪的工作原理 当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内。第18页，共74页，2

8、022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 一、流式细胞仪的分类 （一）流动室与液流驱动系统 （二）激光光源与光束成形系统 （三）光学系统 （四）信号检测与分析 （五）细胞分选器 二、流式细胞仪的基本结构第19页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构一、流式细胞仪的分类流式细胞仪根据功能不同可分为临床型和科研型。临床型只有分析功能，没有分选功能，操作简便，易学易掌握。科研型既有分析功能又有分选功能，可快速将所感兴趣的细胞分选出来。第20页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞

9、仪的分类和基本结构一、流式细胞仪的分类流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。前者的光斑直径大于被检细胞体积，只能提供细胞内某种生物化学成分的参数。狭缝扫描流式细胞仪被检细胞直径大于激光光斑直径，可计算出细胞直径大小、核直径大小、核浆比例等一系列的形态学信息的定量资料。 第21页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类与结构 狭缝扫描流式细胞仪 被检细胞直径大于激光光斑直径，细胞通过光束时各部分被依次扫描。第22页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构二、流式细胞仪的基本结构

10、（一）流动室与液流驱动系统流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。 第23页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 由右图可知，空气泵产生压缩空气，通过鞘流压力调节器加在鞘液上一恒定的压力，这样鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。 第24页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 由于激光焦

11、点处能量分布为正态分布（见图），中心处能量最高。因此，当样本速率选择高速时，处在样本流不同位置的细胞或颗粒，受激光照射的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同。 第25页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构（二）激光光源与光束成形系统 激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照。由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1s左右，且细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。 第26页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式

12、细胞仪的分类和基本结构（三）光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和小孔组成。滤光片主要分为：1.长通滤光片 长通滤光片使特定波长以 上的光通过。2.短通滤光片 特定波长以下的光通过。3.带通滤光片 带通滤光片允许一定波长 范围内的光通过第27页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构（四）信号检测与分析 当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，细胞内不同物质产生不同波长的荧光信号。这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。第28页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的

13、分类和基本结构（四）信号检测与分析 1.散射光信号 散射光分为前向角散射和侧向角散射，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，称为细胞的物理参数（或称固有参数）。（1）前向角散射 前向角散射与被测细胞的大小有关（2）侧向角散射 侧向散射光可提供细胞内精细结构和颗粒性质的信息。第29页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构（四）信号检测与分析 2.荧光信号 当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧

14、光信号的检测和定量分析能了解所研究细胞的性质和数量。第30页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构（四）信号检测与分析2.荧光信号 （1）荧光信号线性测量和对数测量线性放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表面抗原等的荧光检测时通常使用对数放大器。第31页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构（四）信号检测与分析2.荧光信号 （2）荧光信号的面积和宽度荧光信号的面积是采用对荧光光通量进 行积分测量，一般对DNA倍体测量时采

15、用 面积，这是因为荧光脉冲的面积比荧光 脉冲的高度更能准确反映DNA的含量。荧光信号的宽度常用来区分双连体细胞。第32页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构（四）信号检测与分析2.荧光信号 （3）光谱重叠的校正 当细胞携带两种荧光受激光激发而发射两种不同波长的荧光时，理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测，但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠。第33页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 从右图中可以看出，阴影为探

16、测器检测光谱的范围，FITC探测器会探测到少量的PE光谱，而PE探测器则检测到较多的FITC光谱。 第34页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 图中点A通过透镜f成像在A处，而点B通过透镜f成像在B处。在光电倍增管前放上一小孔，作为空间滤波器，排除其它杂散光信号，从而确保了A点光源进不了B点处，B点光源也进不了A点处。 第35页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构（五）细胞分选器1小水滴的形成压电晶体带动流动室振动，液流形成水滴。 喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的数目。当喷嘴直径为50

17、m时，信号频率为40kHz，则每秒钟产生4万个水滴。若每秒钟流出的细胞是1000个，则平均每40个水滴中只有一个水滴是有细胞的，其他皆为空白。 第36页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构（五）细胞分选器2逻辑电路 为了分选细胞，需要细胞在经过测量区时判断出哪个细胞满足了分选的条件，并产生一个逻辑信号，此信号驱动充电脉冲发生器，使之产生充电脉冲。第37页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构（五）细胞分选器3水滴的充电与偏转 当水滴从流束上将要断开时给整个流束充电，则水滴从流束上断开后便带

18、有同极性的多余表面电荷。下落的水滴通过一对平行板电极形成的静电场时，带正电荷的水滴向带负电的电极板偏转，这样就可用容器收集水滴。 第38页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第二节 流式细胞仪的分类和基本结构（六）FCM测量数据的存贮、显示与分析 目前FCM数据的存贮的方式均采用列表排队(List Mode)方式。目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光标记物参数数量在逐渐增多。采用List Mode方式可大量节约内存和磁盘容量。第39页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第三节 流式细胞仪的主要性能指标 一、荧光测量灵敏度 二、仪器的分辨率 三、前向角散

19、射光检测灵敏度 四、FCM分析速度 五、FCM分选指标第40页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第三节 流式细胞仪的主要性能指标一、荧光测量灵敏度 灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标。一般以能检测到单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子数目来表示，现在的FCM均可达到检测小于100个荧光分子的指标。第41页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第三节 流式细胞仪的主要性能指标二、仪器的分辨率 分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV(Coefficient of Variation)值表示：(是分布的标准误差，是分布的平均值)第

20、42页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第三节 流式细胞仪的主要性能指标三、前向角散射光检测灵敏度 前向角散射光检测灵敏度是指能够检测到的最小颗粒大小，一般目前商品化的FCM可以测量到0.20.5左右。第43页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第三节 流式细胞仪的主要性能指标四、FCM分析速度 分析速度以每秒分析的细胞数来表示。当细胞流过光束的速度超过FCM仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会丢失，这段时间称为仪器的死时间。 死时间越短，仪器处理数据越快，一般可达到30006000个/秒左右。大型机已达到每秒几万个细胞。第44页，共74页，2022

21、年，5月20日，11点21分，星期四第三节 流式细胞仪的主要性能指标五、FCM分选指标 分选指标主要包括分选速度、分选纯度和分选收获率。 分选速度指每秒可提取所要细胞的个数。 分选纯度指要分选的目的细胞占分选出 细胞的百分比。 分选收获率指被分出的细胞与原来溶液 中该细胞的百分比。第45页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第四节 流式细胞仪应用的技术要求 流式细胞分析仪器是一项集多学科知识综合应用的复杂仪器，除了对仪器各方面性能指标有严格的要求以外，在实验设计与样品处理方面也需要有丰富的基础理论及操作经验。 一、检测样品制备的重要性 二、常用的荧光染料与标记染色 三、FC

22、M操作技术的质量控制第46页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第四节 流式细胞仪应用的技术要求 一、检测样品制备的重要性 因为流式细胞仪测量的是每个细胞所产生的散射光和荧光信号，如果两个或多个细胞间粘连重叠或细胞碎片过多，都会影响信号的收集及所收集信号的真实性，所以制备单细胞悬液是进行流式细胞仪分析最关键的第一步。第47页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第四节 流式细胞仪应用的技术要求 二、常用的荧光染料与标记染色 散射光信号是激光照在细胞上所产生的前向光和侧向光信号。荧光信号来自于细胞的自发荧光或被分析细胞经特异性荧光标记染色后通过激光束激发后所

23、产生的。因此，被分析细胞在制备成单细胞悬液后，经过与荧光染料染色后才能上机进行检测。第48页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第四节 流式细胞仪应用的技术要求 三、流式细胞仪操作技术的质量控制 在临床检测中，应对各个工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，以保证各项检测数据和指标的可靠性。 1光路与流路校正 2PMT校准 3绝对计数的校准第49页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第四节 流式细胞仪应用的技术要求 1光路与流路校正 主要目的在于确保激光光路与样品流处于正交状态，使仪器检测时的变异减少到最小，从而控制仪器的CV值。在流路校正物中

24、，有标准大小的荧光微球，其物理性质、生物学特性和化学特性均经过标定。 第50页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第四节 流式细胞仪应用的技术要求 2PMT校准 流式细胞仪在使用过程中，光电倍增管随时间的增加，其放大功率会有所改变，对样品检测的灵敏度会产生影响。为保证样品检测时仪器处于最佳工作状态，采用质控品进行PMT校准，必要时进行电压补偿。第51页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第四节 流式细胞仪应用的技术要求 3绝对计数的校准 为保证仪器在计数时的准确性，仪器应采用绝对计数标准品建立绝对计数标准。该标准品是经标定的，如以计算1000个细胞为1m

25、l，作为设定标准。在样本测定时，以此为标准进行绝对计数，从而获得绝对计数的标准值。第52页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第五节 FCM的维护及常见故障的排除 一、仪器的维护1.激光电源的波动范围应小于10%。2.冷却水须用过滤器，并保证压力和流量。3.室温在1824，相对湿度小于85%。4.安装单独的可靠的地线。5.仪器操作必须有经过培训的人员操作。6.样品和鞘液管道每周应用漂白粉液清洗。第53页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第五节 FCM的维护及常见故障的排除故障信息 引起故障的原因 解决方法 清洗液高度错误 清洗液少了 加清洗液 清洗液高

26、度警示 清洗液传感器失灵 与公司联系 数据处理速率错误 数据太大，难以处理 稀释样品 文件名错误 输入的文件名与系统冲突 输入另一个文件名 二、常见故障及排除第54页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第五节 FCM的维护及常见故障的排除故障信息 引起故障的原因 解决方法 存取数据时发生错误 流式细胞仪不能存取数据 关开计算机重试 程序错误 软件不能执行该程序 选择主菜单上的重建项 程序号太大 程序号不能大于32 取消一些程序，再输入相应号码 没有激光束 激光器关闭 检查电源，开激光器 二、常见故障及排除第55页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第五节

27、 FCM的维护及常见故障的排除故障信息 引起故障的原因 解决方法 激光器开启错误 激光器门打开 关激光器门 参数太多 选择的参数应小于8个 取消某些参数，重新选择 参数不存在 程序中无此参数 重新建立程序 二、常见故障及排除第56页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第五节 FCM的维护及常见故障的排除故障信息 引起故障的原因 解决方法 样品压力错误 因为样品管坏了，样品不能被压入流动室 换一个样品管 建立样品压力错误 流式细胞仪连接错误 检查连接，开关机重试 鞘液高度错误 鞘液太少 补充鞘液 二、常见故障及排除第57页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期

28、四第六节 流式细胞仪的临床应用 六、FCM对自身免疫性疾病HLA抗原的分析 二、流式细胞仪在血液学中的应用 三、流式细胞仪在细胞生物学中的应用 四、流式细胞仪在肿瘤学中的应用 五、流式细胞仪在AIDS病检测中的分析 七、流式细胞仪在药物学方面的应用 一、流式细胞仪在免疫学中的应用第58页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第六节 流式细胞仪的临床应用一、流式细胞仪在免疫学中的应用 流式细胞术广泛地应用于免疫理论研究及其临床实践，所以有人称之为现代免疫技术基石之一。尤其同单克隆抗体的结合应用，在淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞功能分析、免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫检测、研究细

29、胞周期等方面都起着相当重要的作用。第59页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第六节 流式细胞仪的临床应用二、流式细胞仪在血液学中的应用 血液病多为肿瘤性、免疫性和遗传性疾病，恶性血液病约占其总数一半以上。FCM在血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等方面应用广泛。 第60页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第六节 流式细胞仪的临床应用三、流式细胞仪在细胞生物学中的应用 细胞生物学研究中，应用最频繁也最普通的是细胞周期分析，研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系，包括细胞周期各时

30、相的百分比和细胞周期动力学参数的测定等内容。对同一细胞的参数测定技术则导致了对细胞周期的一些新发现，典型的方法是吖啶橙双染色技术。 第61页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第六节 流式细胞仪的临床应用四、流式细胞仪在肿瘤学中的应用 近年来荧光细胞化学技术的发展，以及荧光探针标记的单克隆抗体，为流式细胞技术研究各种肿瘤抗原、肿瘤蛋白、致癌基因开辟了新途径，极大地提高了肿瘤学的研究水平，并为流式细胞技术在肿瘤学的研究中开辟了更广阔的应用前景。 第62页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第六节 流式细胞仪的临床应用五、流式细胞仪在AIDS病检测中的分析

31、流式细胞术用于AIDS免疫功能的检测是最重要的检测手段，采用三参数荧光标记计数可对T淋巴细胞及亚群进行分析，并通过动态监测T细胞亚群可以对HIV感染者或AIDS发病者进行区别。 第63页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第六节 流式细胞仪的临床应用六、FCM对自身免疫性疾病HLA抗原的分析 利用FCM可以进行HLA-B27HLA-B7双标记抗体检测HLA-B27阳性细胞，同时又可排出交叉反应。通常5897的强直性脊柱炎患者可检出这种抗原，而正常人仅27可检出这种抗原。FCM检测HLA-B27快速、特异、敏感，为强制性脊柱炎的临床诊断提供了有力的帮助。第64页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四第六节 流式细胞仪的临床应用七、流式细胞仪在药物学方面的应用 流式细胞仪在检测药物在细胞中的分布，研究药物的作用机制方面应用广泛。亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤细胞的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl-2凋亡调节蛋白等进行观察。第65页，共74页，2022年，5月20日，11点21分，星期四 本章小结 本章简要介绍了流式细胞术和流式细胞仪的基本概念。 论述了流式细胞仪的基本原理、