蛋白质合成加工与运输

1、第四章 蛋白生物合成、加工成熟及输运1第一节 蛋白生物合成概述复制(replication);转录(transcription); 反转录(reverse transcription); 蛋白质翻译(translation)中心法则：复制转录RNA蛋白质翻译RNA复制反转录 DNA 加工成熟运输2 一 遗传密码： 1. 三联体密码：3个核苷酸对应一个氨基酸，共64个 2. 密码的基本特性： 5- P, 3-OH 密码没有重叠 密码无标点 密码具有简并性 密码具有摆动性 密码的通用性二 mRNA及转录:ATP , UTP , GTP, CTP, DNA模板 RNA聚合酶 mRNA+PPi真核mR

2、NA前体 hnRNAmRNA(5-帽子，polyA尾巴）多顺反子: 在原核生物中 ，一个mRNA可编码多个蛋白 单顺反子: 在真核生物中，一个mRNA只编码一个蛋白 3三 tRNA及反密码子:二级结构为三叶草; 三级结构为”倒L”形tRNA的两个活性部位： 氨基酸臂和反密码环tRNA的搬运和接头功能4四 核糖体:大亚基功能位点： A位点: 结合氨酰tRNA P位点: 肽酰基位点 E位点: 空载tRNA位点小亚基功能位点： 结合mRNA5五 蛋白生物合成: 1 氨基酸活化（氨酰tRNA合成）: aa-COOH + tRNA-3OH 氨酰tRNA合成酶 aa-tRNA 每一种aa至少有一种氨酰tR

3、NA2 蛋白合成启动:起始氨酰tRNA进入(Met-tRNAi ; fMet-tRNA) 6iiiiii73 肽链延伸: 在延伸因子Ts-Tu帮助下沿NC端合成肽链。催化肽建合成 的是位于大亚基上的肽酰移位酶。每延伸一次消耗2分子GTP（入位、移位）84 蛋白合成终止及释放:9第二节 蛋白前体加工及成熟一 加工类型: 1 N-末端和C-末端的修饰： 在甲酰化酶和氨肽酶的作用下切除起始Met或f Met，有的还被进一步乙酰化； C-末端残基有时也被修饰。 2 -S-S-键的形成： 在生物体内是由专一酶(PDI)所催化 3 aa的修饰： 甲基化：对Arg、His、Lys、Glu 等进行甲基化修饰

4、磷酸化：Ser,Thr,Tyr的单酯；如牛奶酪蛋白 Arg,His,Lys等的磷酰亚胺等 ， 羟化：Pro Hyp等； Pro顺反异构化(PPI所催化)104 异戊二烯基团等的附加： 某些真核蛋白需要被异戊二烯化，异戊二烯来自胆固醇合成，以硫醚键与Cys连接。如：ras肿瘤基因产物、G蛋白等5 糖侧链连接： 某些糖蛋白在合成时或合成后，被共价连接上单糖、寡糖或多糖侧链。连接方式为与Asn形成氮连寡糖链（内质网腔）；或与羟基aa形成氧连寡糖链（高尔基体）6 辅基的附加： 一般是在多肽离开核糖体后才加入的，如Cytc的血红素辅基；乙酰辅酶A羧化酶的生物素辅基等。7 多余肽段的切除： 前体蛋白需切除

5、部分肽段后，才显示生物活性，肽段种类不同，对蛋白成熟具有不同的意义。11二 激素与激素原:1 概念：如胰岛素原( 81aa) 类胰蛋白酶 切除C肽(30aa) 类羧肽酶B 成熟胰岛素(51aa)原肽(propeptide): 其两侧含有成对碱性aa。含原肽的蛋白叫原蛋白2 原肽的功能: 维持肽链具有一定长度或连续性 被切除的原肽具有其他生物学功能 正确定位-s-s- 可形成多聚蛋白: 前脑啡肽: 6Met脑啡肽+ 1Leu脑啡肽 Arg 32Arg 31Arg 60Lys59COOHHA肽B肽C肽 S-S12三 酶与酶原: 酶原（zymogen，proenzyme）：无活性的酶蛋白前体酶原激活

6、：无活性酶原活性酶分子，是酶活性中心形成或 暴露的过程。 1、胰蛋白酶原的激活：胰蛋白酶原由胰脏 细胞分泌，在小肠 中被激活激活在肠激酶或已经激 活的胰蛋白酶作用下从 N-端水解去除六肽胰蛋白酶原的激活是酶 活性中心形成的过程 SSN-IleS-SX -Ser195His57Asp102S-SSSX-Ser195N-Val-(Asp)4-Lys-Ile-Val-Gly-His57肠激酶六肽132、胰凝乳酶原激活：酶原含有245aa，经历两次加工成为活性凝乳蛋白酶第一步： 酶原 -凝乳酶 （胰蛋白酶催化）第二步： -凝乳酶相互催化，去除两个二肽 成为含三个肽段的 活性蛋白酶NC1245-凝乳酶相

7、互作用 Ser14-Arg15Thr147-Asn148SSSSS-SS-SS-S胰蛋白酶SSSSS-SS-SS-SArg15NC124515SSSSS-SS-SS-S-凝乳酶NC12451316146149-凝乳酶14凝乳蛋白酶酶原激活过程中蛋白构象变化： 胰酶切断Arg15-Ile16之后，Ile16内转并以其氨基与酶分 子内部的Asp194-COOH发生静电作用，形成盐键，稳 定初步激活形式。 Met192从分子内部移动至表面 Gly187和Gly193更加伸展 最终在分子表面形成一个允许芳香族及较大侧链非 极性基团进入的底物专一性部位 一个“大口袋”153、胃蛋白酶原激活：由胃壁腺细胞

8、分泌酶原中活性中心已存在，在中性条件下被封闭酶原 前体片断( 44aa,碱性)：6Lys + 1Arg 结构蛋白( 酸性): 酸性侧链 盐键 PH5时羧基质子化盐键断裂 构象重排 活性中心暴露 自我催化胃蛋白酶+前体片段 前胰岛素原（N-信号肽+胰岛素原-C） 信号肽酶 跨膜分泌 信号肽（24aa）+ 胰岛素原 胰岛素 + C肽（30aa）16第三节 信号肽与细胞内蛋白跨膜运输定位一 信号假说（signal hypothesis）：由Blobel 1971年提出信号肽理论70年代末发现并破译第一个信号序列80年代初发现两个功能蛋白: 信号识别蛋白(SRP) , 停泊蛋白(DP) 90年代在内质

9、网上找到了神秘的蛋白通道1999年，Blobel因信号理论获得 Nobel生理/医学奖 17细胞内蛋白质运输存在两类不同的运输机制： 翻译后运送，如蛋白跨越细胞器 细胞内运输机制 边翻译边运送，如蛋白跨越内质网二 信号肽引导的蛋白跨内质网运输：1 信号肽及结构 :粗糙内质网核糖体合成三类主要蛋白： 溶酶体蛋白 分泌到胞外的蛋白 构成脂膜骨架的蛋白某些分泌蛋白、分泌途径的膜蛋白N末端有一段延伸的肽段，可引导蛋白质跨内质网膜，称为信号肽。信号肽跨膜之后一般被信号肽酶水解去除。胰细胞18信号肽广泛存在于真核及原核中，结构上没有专一性，进化 上也没有高度保守性信号肽的结构特点: 1. 信号肽一般由10

10、-30aa残基组成，平均15个左右 2. N-端至少有一个带正电荷的碱性aa，一般4-5个. 3. 中间部分有12-14个aa的疏水区，易于形成-helix，这些 疏水aa若有一个被替换，信号肽即丧失功能 4. C-端与结构蛋白相连部位为富含Ala的片段，易于形成 -sheet，是信号肽酶的识别和切割位点。 5. 信号肽不一定位于蛋白的N-末端。如卵清蛋白的信号肽 位于中部。 6. 某些膜蛋白的信号肽在跨膜之后不被水解掉。Cyt P450 7. 某些复杂膜蛋白可含有不只一个信号肽，如视蛋白Opsin192. 信号肽引导的蛋白跨内质网膜过程：属于边翻译边运输过程：识别 停泊 跨膜 水解（1）识别

11、: 当蛋白质合成50-70个aa时，蛋白 N-端从核糖体中冒出头，信号识别蛋白（SRP）识别并结合到信号肽中部疏水部分，肽合成终止。 随后在SRP引导下，SPR-核糖体-信号肽三元复合体趋向内质网表面。信号识别蛋白SRP（singal recognition particle ）： Mr = 32500，由一个7SRNA + 6Pr 组成 功能域 ： 识别信号肽 干扰进入核糖体的氨酰- tRNA与肽酰移位 酶作用，中止肽合成20（2）停泊(入坞)： 三元复合体在SPR引导下与内质网上的停泊蛋白（DP）结合。 DP与SPR相互作用，肽合成继续，SRP释放停泊蛋白DP: docking prote

12、in： DP为二聚体： 亚基（69000） + 亚基（30000）（3）跨膜：DP引起内质网上核糖体受体蛋白聚集，后者在膜上有形成孔道的能力蛋白质传导通道（PCC，protein-conducting channel） PCC内径只有约2nm，传导通道 + 信号肽(配体) 边翻译边运送 肽进入内质网（4）水解：跨膜后蛋白经信号肽酶水解去除信号肽后成熟， 成熟蛋白在内质网腔中加工、折叠，而PCC关闭。21蛋白质跨内质网过程：22 糖蛋白核心寡糖链的合成233. 膜蛋白跨膜过程：膜蛋白将整合到膜上，而不是跨膜膜蛋白跨膜过程： 蛋白肽链接近C-端处，一般有一由1125个疏水aa和一些紧随其后碱性aa

13、构成的序列，称为终止转移序列（stop transfer sequence）。 终止转移序列可被PCC识别，后打开磷脂双分子层内部的横向通道，使蛋白沿磷脂双分子层向其内部整合。 转移完毕后，PCC两通道同时关闭。目前可能参与PCC构建的多种蛋白质已经得到分离24三 蛋白跨细胞器运送：属于翻译后运输机制 (一) 线粒体蛋白的跨膜运输：导肽(Leader peptide)：线粒体蛋白N末端一段延伸的肽段可识别线粒体，引导蛋白跨膜，对蛋白进行定位。 1 导肽结构特征： 导肽是由20-80个aa残基构成的片断 富含带正电荷的碱性aa，特别是Arg，通常分散在不 带电荷aa之间。不可被不带电荷的aa取代

14、。 几乎不含带负电的酸性aa 羟基aa特别是丝氨酸的含量较高 导肽有形成两亲-helix的倾向 252. 导肽的功能： (1) 识别特征细胞器: 导肽与受体蛋白结合有相对专一性 (2) 导肽的不同片断含有不同的信息。 例如：线粒体Cytc1，它的导肽（61aa）经历两次水解，第一段信息引导蛋白进入线粒体基质；第二段信息引导进入内外膜间隙。 (3) 导肽对被牵引蛋白无特异性要求，Cytc1导肽可以牵引小 鼠二氢叶酸还原酶到线粒体相应部位。3. 导肽与基质蛋白跨膜过程： 胞质前体 ATP 解折叠(接近线性) 导肽 与膜受体结合 Hsp70 牵引 ATP 在内外膜接触点上一次跨双层膜 信号肽水解 跨

15、膜 或先跨外膜，水解第一段导肽后再跨内膜 Hsp60结合 蛋白重折叠 成熟蛋白264 不同线粒体蛋白的导肽及运输定位负责将蛋白运过外膜到膜间隙负责将蛋白运到基质2728 (二) 蛋白跨叶绿体运送：转运肽(transit peptide sequence)： 叶绿体蛋白N末端延伸的一段 肽段，可帮助蛋白进入叶绿体内。不同部位的蛋白其转运肽结构不同： 定位于类囊体膜腔中的蛋白： 其转运肽分为两个区域（导 向基质片断和导向类囊体片段） 定位于叶绿体基质中的蛋白： 其转运肽只经历一次降解叶绿体内蛋白的定位复杂，除转运肽之外还需要借助其它因子，如叶绿体识别蛋白的54000亚基cpSRP54。29示例：类

16、囊体膜蛋白 Lhcb1 前体Lhcb1(在胞质中) 转运肽，cpRSP54 跨叶绿体内外膜 Hsp70， GTP 蛋白N-端进入基质，转运肽即被水解 第一个滞留片段（-Glu-X-X-His-X-Arg-）使Lhcb1停留在 类囊体膜上。其中的His和Glu/Arg对与叶绿素和叶黄素结 合，并启动Lhcb1折叠。若无足够叶绿素， Lhcb1将会退 回到细胞质中，被水解掉。 第二个滞留片段（-Glu-X-X-Gln-X-Arg-）使Lhcb1的C- 端停留在类囊体膜上。其中的Gln和Glu/Arg对与两个叶 绿素结合，否则Lhcb1将会被运到基质中被水解掉。 Lhcb1与叶绿素及其它色素结合，并

17、完成构象调整。Lhcb1的跨膜是成熟、装配、折叠同步进行，受多因素调控 基质叶绿体基质类囊体外膜内膜进入液泡30四 核内蛋白的运输：1 核定位序列（NLS, nuclear location sequence)功能：引导核内蛋白跨越核膜。特征: 一般为10个aa构成的短片断。 富含碱性aa ，有时也含Pro NLS可是连续片断，也可分隔为两个不连续 片断，中间间隔大于10个aa左右。 NLS可位于蛋白的不同部位312 核内蛋白运输机制：核孔复合体 (NPCs， nuclear pore complexes) 核膜表面的核孔中间结合着的一个圆筒形的亲水通道。长约15nm=9nm，是一个大而复杂的细胞器。 32跨膜过程：也属于翻译后运输 Pr- NLS 转运复合物 转运Pr-亚基 停泊在NPC纤毛上 转运Pr- 亚基 纤毛摆动 核质 Ran - GTP 转运复合物解离 Pr释放 NPC纤毛NPC33 注: NLS只