广州大学转化子筛选设计

1、3。通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子。但因PCR技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要进一步进行鉴定。从疑似重组子中进行摇菌培养观察菌株表达形态，若出现荧光蛋白则说明菌株成功转化并表达了EGFP增强型荧光蛋白。2材料与方法2.1 实验材料E. coli DH5菌株：R-，M-，Amp-；实验五的连接产物： pMD19-T + EGFP2.2 试剂含氨苄青霉素(Amp, 100mg/L)的LB固体培养基；X-gal储存液（200mg/ml）；IPTG储存液（20mg/ml）；0.1 mol/L CaCl2溶液2.3 仪器无

2、菌操作台；电泳系统，凝胶成象系统(BIO-RAD Co.)，移液枪（Dragon Co.），灭菌的PCR管，离心管，枪头等2.4 转化产物的涂布在事先制备好的含100 mg/L Amp的LB平板表面（中央位置）加40l X-gal储存液和4 l IPTG储存液，用无菌玻棒将溶液涂布均匀，置于超净工作台上，使培养基表面的液体完全被吸收。取500 l复壮后的转化菌液（实验六：感受态细胞的制备和转化）涂布于筛选培养基表面，待菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住培养皿边缘，倒置培养皿，37培养过夜。2.5 转化子的蓝白斑筛选含有Amp的筛选培养基中长出的菌落中挑选出5个白色单菌落，并做好标记，这5个单

3、菌落即为可疑转化子。2.6 菌落直接PCR在PCR管中配制50L反应体系。反应体系如下：10PCR buffer 5l；dNTP mixture 4l；前向引物(P1：EGFP-F: 5-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3(Tm=65.5)(SalI)2l；反向引物(P2:EGFP-R:5-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3(Tm=61.5)(Xba I) ) 2l；rTaq酶 0.5l；灭菌蒸馏水 36.5l。将上述体系轻轻混匀,稍离心即可。然后按每管10L分装至5个反应体系。最后用无菌牙签把5个白色单菌落挑出并分别加入5个反应体

4、系中（每个菌落仅挑出1/2面积，即在LB平板上剩余1/2用于后续培养实验）。为了防止PCR反应过程中热盖效果不佳导致混合液蒸发,最后在每个反应体系中添加10L矿物油。PCR仪的参数设置为：94 2min，94 30s；61 30s；72 45s（40个循环），72 5min，10 save2.7 琼脂糖凝胶电泳结果观察各管中取10l PCR产物并与1l 10loading buffer充分混合，并将混合物进行上样工序，以电压110V电泳15min，随后进行2琼脂糖凝胶电泳检测，并将电泳完成的琼脂糖胶板放置紫外线下进行观察拍摄。 2.8 转化子的培养把电泳结果中有荧光条带的2个样品分别接种到装有

5、已加入氨苄青霉素的15ml LB液态培养基的锥形瓶，然后将锥形瓶放置到摇床中过夜恒温培养，于第二天观察菌株生长情况。3结果和分析3.1 蓝白斑筛选结果图1蓝白斑筛选结果fig 2 Results of Blue-White spot screening 3.2 电泳结果图2 本组菌落直接PCR后的琼脂糖电泳结果（1、2、3、4、5为挑选菌落）fig 2 Results of agarose electrophoresis using 5 Colony PCR products of this group图3 平衡组菌落直接PCR后的琼脂糖电泳结果fig 3 Results of agarose

6、 electrophoresis using 5 Colony PCR products of parallel groups3.3 LB（含Amp）培养基摇瓶培养结果图4 摇瓶培养的菌落生长情况Fig 4 The growth condition of E.coli using Shake flask culture3.4 蓝白斑筛选结果分析由图一所示，本实验LB平板上成功出现了蓝色菌落和白色菌落。并随后挑选其中靠近蓝色菌落的5处白色菌落进行后续菌落PCR和摇瓶培养。本实验采用的载体质粒是经Takara公司改良后的 pMD19-T Vector，与pMD18-T Vector相比，-半乳糖苷

7、酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。本实验中pMD19-T Vector涂板培养约24小时（37）。当外源EGFP DNA片段成功插入至pMD19-T Vector并进入到宿主E.coli使其成为转化子后，一般情况下-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但根据Takara pMD19-T Vector使用说明书介绍，有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称，2 kb的DNA片段插入到载体中后，重组克隆体仍显示了蓝色。

8、所以，进行阳性克隆检测时，尽管蓝白斑筛选实验已经成功地对转化子进行初筛，成为鉴定转化子的方法之一，但为降低假阳性造成的干扰。我们要进一步使用PCR的方法。3.4 菌落PCR电泳结果分析根据图2的电泳结果可知，本人组连同另外4个平行组均未电泳出正常的图谱，该判断依据在于Marker DL 2000泳道亦未出现100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp的预期清晰图谱。由此推断，电泳仪在工作过程中出现了不可预计错误，导致电泳仪无法正常工作，原因可能是电泳液浓度不均或存在过多的琼脂糖沉淀阻塞导致局部电压不均匀，使DNA分子不能正常向负极移动。由于本实验扩增用引物采用了P

9、1：EGFP-F: 5-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3(Tm=65.5) (Sal I)；P2：EGFP-R: 5-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3(Tm=61.5) (Xba I)，目的是通过琼脂糖凝胶电泳观察是否扩增出EGFP基因片段大小的图谱，故根据平行组实验结果（图3），可以观察到EGFP DNA片段的电泳图谱。说明菌落直接PCR成功鉴定出含pMD19T-EGFP质粒的大肠杆菌DH5。即已经成功鉴定出转化子。3.4 摇瓶培养结果由于本组实验中电泳仪工作出错导致菌落PCR的电泳结果无法成功鉴定转化子。故本实验根据电泳图中

10、的轻微疑似图谱，挑选1号和3号白色菌落进行摇瓶培养。经过24小时（37）的摇瓶培养后，再对锥形瓶内产物进行蓝光照射观察其荧光效果。结果表明（图4），3号菌落为含pMD19T-EGFP质粒的大肠杆菌DH5，能成功产生增强型荧光蛋白EGFP，而1号菌落为假阳性白色菌落，不含pMD19T-EGFP质粒或不含有pMD19T Vector中不含有EGFP基因。综合以上实验结果证明，摇瓶培养最终成功鉴定并筛选出目的转化子。4讨论与小结本次综合实验成功的筛选并鉴定出号菌是成功的pMD19T-EGFP转化子大肠杆菌DH5，达到了实验预期结果。通过蓝白斑筛选、菌落直接PCR、摇瓶培养3个鉴定筛选转化子的方法，实

11、质上是循序渐进地去精确筛选出目的转化子的过程。3个步骤连贯配合，共同对假阳性结果进行排除，一步一步对干扰实验结果的因素进行排除，从而达到实验目的。最终成功精确地筛选出能表达出EGFP的目的转基因菌株。参考文献Shimomura O. Structure of the chromophore of Aequorea, green fluorescent proteinJ. Febs Letters, 1979, 104(2):220-222.薛启汉. 绿色荧光蛋白(GFP)的特性及其在分子生物学研究中的应用J. 江苏农业学报, 1999(1):52-58.田长恩. 生物工程上游技术实验手册M. 科学出版社,