药典三部(2015版)通则支原体检查法

1、精选文档3301支原体检查法主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、比较细胞以及临床治疗用细胞进行支原体检查时，应同时进行培育法和指示细胞培育法（DNA染色法）。病毒类疫苗的病毒收获液、原液采纳培育法检查支原体，必需时，亦可采纳指示细胞培育法挑选培育基。也可采纳经国家药品检定机构认同的其余方法。第一法培育法介绍培育基及其处方支原体液体培育基支原体肉汤培育基猪胃消化液500ml氯化钠2.5g牛肉浸液（12）500ml葡萄糖5.0g酵母浸粉5.0g酚红0.02gpH值7.60.2。于121灭菌15分钟精氨酸支原体肉汤培育基猪胃消化液500ml葡萄糖1.0g牛肉浸液（12）500mlL-精氨酸2.0g酵母

2、浸粉5.0g酚红0.02g氯化钠2.5gpH值7.10.2。于121灭菌15分钟支原体半流体培育基按项处方配制，培育基中不加酚红，加入琼脂2.53.0g。支原体琼脂培育基按项处方配制，培育基中不加酚红，加入琼脂13.015.0g。除上述介绍培育基外，亦可使用可支持支原体生长的其余培育基，但敏捷度一定切合要求。培育基敏捷度检查（变色单位试验法）菌种肺炎支原体（ATCC15531株）、口腔支原体（ATCC23714株），由国家药品检定机构散发。操作将菌种接于适合的支原体培育基中，经361培育至培育基变色，盲传两代后，将培育物接种至待检培育基中，做10倍系列稀释，肺炎支原.精选文档体稀释至10-71

3、0-9，接种在支原体肉汤培育基内；口腔支原体稀释至10-310-5，接种在精氨酸支原体肉汤培育基内。每个稀释度接种3支试管，置361培养714天，察看培育基变色结果。结果判断以接种后培育基管数的2/3以上体现变色的最高稀释度为该培育基的敏捷度。液体培育基的敏捷度：肺炎支原体（ATCC15531株）应达到10-8，口腔支原体（ATCC23714株）应达到10-4。检查法供试品如在分装后24小时之内进行支原体检查可储存于28；超出24小时应置-20以下储存。检查支原体采纳支原体液体培育基和支原体半流体培育基（或支原体琼脂培育基）。半流体培育基（或琼脂培育基）在使用前应煮沸1015分钟，冷却至56左

4、右，而后加入灭能小牛血清（培育基血清为82），并可酌情加入适当青霉素，充分摇匀。液体培育基除无需煮沸外，使用前亦应相同补加上述成分。取每支装量为10ml的支原体液体培育基各4支、相应的支原体半流体培育基各2支（已冷却至361），每支培育基接种供试品0.51.0ml，置361培育21天。于接种后的第7天从4支支原体液体培育基中各取2支进行代次培养，每支培育基分别转种至相应的支原体半流体培育基及支原体液体培育基各2支，置361培育21天，每隔3天察看1次。结果判断培育结束时，如接种供试品的培育基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格

5、，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。【附注】质量检定部门应会同培育基制造部门按期抽检支原体培育基敏捷度。第二法指示细胞培育法（DNA染色法）将供试品接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认同的其余细胞）中培育后，用特异荧光染料染色。如供试品污染支原体，在荧光显微镜下可见附在细胞表面的支原体DNA着色。试剂二苯甲酰胺荧光染料（Hoechst33258）浓缩液称取二苯甲酰胺.精选文档荧光染料5mg，加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hanks均衡盐溶液中，在室温用磁力搅拌3040分钟，使完整溶解，-20避光保留。二苯甲酰胺荧光染料工作液无酚红和碳酸氢钠的Hanks溶液100m

6、l中加入二苯甲酰胺荧光染料浓缩液1ml，混匀。固定液乙酸甲醇（13）混淆溶液。封片液量取0.1ml/L枸橼酸溶液22.2ml、0.2mol/L磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油50.0ml混匀，调pH至5.5。培育基及指示细胞DMEM完整培育基。DMEM无抗生素培育基。指示细胞（已证明无支原体污染的Vero细胞或其余传代细胞）取培育的Vero细胞经消化后，制成每1ml含105的细胞悬液，以每孔0.5ml接种6孔细胞培育板或其余容器，每空再加无抗生素培育基3ml，于5%二氧化碳孵箱361培育留宿，备用。供试品办理细胞培育物将供试品经无抗生素培育液起码传一代，然后取细胞已长满的且3天未换液的细胞培育

7、上清液待检。毒种悬液如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判准时，应用对支原体无克制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细胞进行检查。其余供试品检查时所采纳的指示细胞应为该供试品对其生长无影响的细胞。测定法于制备好的指示细胞培育板中加入供试品（细胞培育上清液）2ml（毒种或其余供试品起码1ml），置5%二氧化碳孵箱361培育35天。指示细胞培育物起码传代1次，末代传代培育用含盖玻片的6孔培育板培育35天，吸出培育孔中的培育液，加入固定液5ml，搁置5分钟，吸出固定液，再加入5ml固定液固定10分钟，吸出固定液，使盖玻片在空气中干燥，加二苯甲酰胺荧光染料（或其余DNA染料）工作液5ml，加盖，室温搁置30分钟，吸出染液，每孔用水5ml洗3次，吸出水，盖玻片于空气中干燥，取干净载玻片加封片液1滴，分别将盖玻片面向下盖在封片液上制成封片。用荧光显微镜察看。用无抗生素培育基2ml代替供试品，同法操作，作为阴性比较。.精选文档用已知阳性的供试品标准菌株2ml代替供试品，同法操作，作为阳性比较。结果判断阴性比较仅见指示细胞的