酶生物传感器市公开课金奖市赛课一等奖课件

1、1第四章 酶生物传感器 Enzyme Biosensor 一、酶本质与特征 酶本质 酶是生物体内产生、含有催化活性一类蛋白质。 依据化学组成份为两大类，即单纯蛋白酶与结合蛋白酶。 依据酶催化反应类型分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、异构酶等。 第1页2 酶基本特征 酶高效催化性 酶催化效率通常比普通催化剂高106-1012倍。酶之所以能高效催化，是经过降低反应所需活化能实现。 第2页3 酶高度特异性 酶不但含有普通催化剂加紧反应速度作用，而且含有高度特异性。 绝对特异性 相对特异性 立体异构特异性第3页4酶促反应动力学 酶促反应动力学是研究酶反应速度及各种原因对酶反应速度影响科学。 主要影响原因

2、包含有：底物浓度、酶浓度、 pH值、温度、抑制剂与激活剂等。 第4页5 酶动力学测定是初速度，是指酶在反应过程中底物初始浓度被消耗在5%以内速度。目标是排除酶反应过程中出现各种干扰原因，方便测得准确酶反应速度。 第5页6底物浓度对酶促反应速度影响 第6页7酶浓度对酶促反应速度影响 若底物初始浓度固定时，酶反应速度与酶浓度呈线性关系。第7页8温度对酶促反应速度影响 每一个酶催化反应都有适宜温度范围和最适温度。第8页9pH对酶促反应速度影响 每一个酶都有适宜pH值范围和最适pH值。在一定pH下，酶促反应含有最高反应速度，此pH称为该酶最适pH。 第9页10第10页11抑制剂、激活剂对酶促反应速度影

3、响 凡能降低酶活性甚至使酶完全失活物质称为抑制剂，抑制剂种类很多，包含药品、抗生素、毒物、抗代谢物以及酶促反应产物等。第11页12 凡能激活酶活性物质，均称激活剂。一些酶必须有激活剂存在，才能进行酶促反应。激活剂大部分为一些无机离子，也有一些有机分子。 第12页13二、酶传感器 酶传感器是应用固定化酶作为敏感元件与各种信号转换器组合而成生物传感器。 依据信号转换器类型，酶传感器大致可分为酶电极、酶场效应管传感器、酶热敏电阻传感器、酶压电晶体型、光纤光学型等。 第13页14 传感器类型第14页154.1 酶电极传感器 Enzyme electrode sensor 酶电极是由固定化酶与电流型电极

4、或电位型电极组合而成生物传感器。 含有酶分子识别和选择催化功效，又有电化学电极响应快、操作简便特点，能快速测定试液中某一给定化合物浓度，且需极少许样品。 第15页16电流型酶电极 电流型酶电极是将酶促反应产生物质在电极上发生氧化或还原反应产生电流作为测量信号，在一定条件下，利用测得电流信号与被测物活度或浓度函数关系，来测定样品中某一生物组分活度或浓度。第16页17制作生物传感器最惯用是氧化酶： 底物+O2 产物+H2O2第17页18 基础电极可采取氧、过氧化氢电极，还可采取近年开发介体修饰炭、铂、钯和金等固体电极或介体修饰电极。第18页19 氧电极：是一个经过测定电解电流来测定溶液中氧含量电解

5、池。 工作时，在铂阴极和Ag阳极之间施加0.6V电压。当E=-0.2V时电极开始电解，产生还原电流，其还原反应式为：第19页使用最多是封闭式Clark氧电极第20页21 铂电极与Ag电极组合在一起置于参比溶液中，与被测溶液之间用透氧膜隔开。被测溶液中溶解氧经过膜扩散到电解质溶液薄层，再扩散到铂电极表面进行还原产生电流。第21页H2O2电极H2O2电极基本测量电路和电压-电流曲线 第22页 两极间外加一定电压，实际测量时，外加电压控制在电压-电流曲线平滑部分，即0.7-0.9V，此时输出电流就与浓度成百分比。阳极反应阴极反应 第23页24第24页251.葡萄糖传感器 葡萄糖传感器是研究最早、开发

6、最成熟并已市场化生物传感器，即血糖仪。各种型号血糖仪产品第25页26（1）早期葡萄糖传感器 早期葡萄糖传感器是由葡萄糖氧化酶膜和电化学电极组成。在电化学电极透气膜上固定葡萄糖氧化酶。第26页27当葡萄糖溶液与酶膜接触时，发生以下反应：第27页28故葡萄糖浓度测试方法有三种： 生成葡萄糖酸 消耗氧 生成H2O2第28页29测量葡萄糖酸葡萄糖传感器： pH电极和离子敏场效应管测定葡萄糖酸量来计算样品中葡萄糖含量，最低检测限为10-3 molL，灵敏度较低；第29页测量氧消耗量葡萄糖传感器：30 Clark氧电极用于测定酶促反应中氧消耗量(电流降低量)来计算样品中葡萄糖含量，最低检测限为10-4 m

7、olL 。第30页31 葡萄糖氧化产生H2O2， H2O2经过选择性透气膜，在Pt电极上氧化，葡萄糖含量与生成电流成正比，由此可测出葡萄糖浓度。 检测H2O2方法本底电流小，灵敏度高，其最低检出限为10-8molL。测量H2O2生成量葡萄糖传感器：第31页32（2）改进葡萄糖传感器 为消除环境中氧对测定干扰，用四硫富瓦烯、二茂铁等轻易在电极上氧化还原介体来代替氧电子传递作用。电子介体是酶氧化还原活性中心与电极表面之间电子传递中介物，在电流型酶电极中起着关键性作用。 各种电子传递介体使用，使得电流型酶传感器响应速度、检测灵敏度和选择性都得到了很大提升。第32页33 方法：将葡萄糖氧化酶和电子介体

8、同时包埋于聚合物膜中，或直接修饰于电极表面组成葡萄糖酶传感器。第33页34 在葡萄糖氧化酶（ ）催化下，葡萄糖被氧化为葡萄糖酸，再由二茂铁离子将还原型葡萄糖氧化酶（ ）氧化为氧化型葡萄糖氧化酶（ ），然后二茂铁在电极上氧化成二茂铁离子，经过二茂铁在电极上产生氧化电流来实现葡萄糖含量检测。第34页35介体传感器特点：仅用较低电压就能使介体氧化。传感器对氧不敏感，能在缺氧和氧浓度 改变条件下使用。二茂铁离子与还原GOD之间电子传递 快，电极响应快速。第35页36 采取场效应晶体管和微电极做换能器，以缩小传感器体积； 利用电子技术、改进信号放大和显示方法，使其易于商品化； 改进采样方法，使患者使用方

9、便或更易于临床应用。 最主要改进是使用化学电子传递中间介体代替作为自然电子受体氧，使酶催化反应不再受到溶解氧含量制约。第36页37（3）血糖仪测试片血糖仪测试片 第37页38手表式葡萄糖传感器第38页第39页40 手表式无创血糖仪是近年来出现一个无创、无痛，能连续测定血糖设备。它经过电化学传感器和电渗透原理来检测皮下组织液中葡萄糖浓度，无需针刺采血。 手表式血糖仪测定是组织间液葡萄糖值，所以要略滞后于指血血糖值。 第40页41(2)乳酸电极 血液中乳酸浓度是反应人体体力消耗程度主要指标。在体育运动训练中乳酸检验是极为必要，国际上乳酸传感器已经有成熟商品仪器。第41页第42页43 还可采取介体修

10、饰方法制备乳酸传感器。 在电极上滴介体四硫富瓦烯(TTF)浆液，晾干后，将乳酸氧化酶固定在该电极表面修饰层上面，即组成乳酸传感器。第43页44第44页45 在乳酸氧化酶催化下，乳酸被氧化为丙酮酸，再由四硫富瓦烯离子将还原型乳酸氧化酶氧化为氧化型乳酸氧化酶，然后四硫富瓦烯在电极上氧化成四硫富瓦烯离子，经过四硫富瓦烯在电极上产生氧化电流来实现乳酸含量检测。第45页46(3)胆固醇电极 胆固醇电极是一个用于临床测定血清胆固醇含量电流型酶传感器。血液中胆固醇约有23以酯型存在，13以游离型存在。第46页 自然界中胆固醇主要存在于动物性食物之中，植物中没有胆固醇。 兽肉胆固醇含量高于禽肉，肥肉高于瘦肉，

11、贝壳类和软体类高于普通鱼类，蛋黄、鱼子、动物内脏胆固醇含量非常高。 第47页降低胆固醇食物： 含膳食纤维丰富食物 VC 与 VE 饮酒可能使血中高密度脂蛋白升高，加强防治高胆固醇血症作用。葡萄酒较适当，但必须严格限制摄入量。 第48页49 胆固醇电极是一个用于临床测定血清胆固醇含量电流型酶传感器。结合型酶电极第49页50 依据反应过程中消耗氧，产生过氧化氢，用对应电极组成胆固醇传感器测定电流改变量，在一定条件下，电流改变量与胆固醇浓度呈线性相关。第50页51(4）肌酸和肌酸酐电极脱水肌酸肌酸酐第51页 血清肌酸肝含量测定是衡量肾功效一个很好基准。 血清肌酸酐浓度不会因食物种类而受影响，所以做为

12、判断肾脏机能依据较血清尿素可靠。 血清肌酸酐浓度与肌肉量相关，所以肌肉多排放尿肌酸酐浓度会比肌肉少多。 第52页53第53页54 肌酸和肌酸酐微传感器第54页55（5）磷酸盐电极佝偻病软骨病第55页56葡萄糖-6-磷酸盐葡萄糖 + 磷酸酸性磷酸酯酶葡萄糖 + O2葡萄糖酸 + H2O2葡萄糖氧化酶第56页57（6）淀粉电极淀粉葡萄糖淀粉酶葡萄糖 + O2葡萄糖酸 + H2O2葡萄糖氧化酶第57页58（7）乙醇电极CH3CH2OH 可用乙醇来制造醋酸、饮料、香精、染料、燃料等。 医疗上也惯用体积分数为70-75%乙醇作消毒剂等。 第58页酒后驾驶饮酒驾车：指驾驶员血液中酒精含量大于或等于20 m

13、g/100 mL小于80 mg/100 mL驾驶行为。 350 mL(约相当于1小瓶)啤酒或半两白酒(20 mL)第59页醉酒驾车：指驾驶员血液中酒精含量大于或等于80 mg/100 mL驾驶行为。 1400 mL(约相当于3瓶500 mL)啤酒或一两半白酒(80mL) 第60页C2H5OH + NAD+CH3CHO + NADH醇脱氢酶NADH + Fe(CN)64-NAD+ + Fe(CN)63- + H+ + e-第61页62（二）电位型酶电极 电位型酶电极是将酶促反应所引发物质量改变转变成电位信号输出，电位信号大小与底物浓度对数值呈线性关系。 第62页电位型酶电极所用基础电极是对某种离

14、子有选择性或对气体有选择性电极离子选择性电极气敏电极第63页64第64页 1773年，伊莱尔罗埃尔（Hilaire Rouelle）发觉尿素。 1828年，德国化学家弗里德里希维勒首次使用无机物质氰酸氨（由氯化铵和氯酸银反应制得）与硫酸铵人工合成了尿素。 弗里德里希维勒（Friedrich Wohler）尿素电极 第65页尿素分子模型增高：急性或慢性肾小球肾炎、肾功效衰竭、尿路阻塞、尿路肿瘤、高蛋白质饮食等。减低：妊娠后期、蛋白质摄入不足、营养不良等。第66页67 尿素在脲酶作用下发生水解反应可用氨气敏电极、二氧化碳电极等作为基础电极测定尿素含量。 第67页（2）草酸电极草酸（乙二酸）结构式

15、维生素C代谢 甘氨酸代谢 草酰乙酸水解 异柠檬酸降解 食物摄入：菠菜、茶叶 生物体内草酸起源：第68页草酸 草酸脱羧酶2CO2 + 甲酸第69页（3）腺苷电极 参加心肌能量代谢 扩张血流量 合成ATP、腺苷酸主要中间体第70页腺苷腺嘌呤脱氨基酶肌苷 + NH3第71页（4）苯丙氨酸电极 哺乳动物必需氨基酸 是甜味剂阿斯巴甜主要原料第72页苯丙氨酸苯丙氨酸胺裂解酶反式肉桂酸盐+ NH3第73页744.2 酶场效应晶体管传感器(ENFET) ENFET将酶膜复合在ISFET栅极。 测量时，酶催化作用使待测分子反应生成ISFET能够响应离子。 第74页ISFET工作原理第75页76 敏感膜与溶液界面

16、产生膜电位，该电位叠加在栅压上，引发场效应管漏电流改变。依据能斯特方程，膜电位大小与溶液中离子活度相关，即:第76页77（一）葡萄糖-FET 葡萄糖-FET是由对H+ 敏感ISFET和固定在其栅极上葡萄糖氧化酶膜组成。第77页78 酶催化底物反应时，生成葡萄糖酸根、H+ 和过氧化氢，造成酶膜附近pH值改变，且pH改变量与葡萄糖含量相关。 溶液中H+浓度改变，离子敏感膜与溶液界面膜电位发生改变，该电位叠加在栅源电压上，栅源电压改变与溶液中pH值改变量成线性关系。葡萄糖-FET工作原理：第78页 为提升葡萄糖-FET工作性能和测量精度，可采取两个pH敏感场效应管组成差动式结构。双栅极酶-FET传感

17、器第79页80 一个FET栅极固定葡萄糖氧化酶膜，作为工作FET；另一个FET栅极上没有酶膜，作为参比FET。将2个FET接到差动放大器上，干扰原因被消除，使输出电压只对葡萄糖响应，所以输出电压改变能够反应葡萄糖含量改变。第80页81（二）尿素-FET 尿素-FET是由H+-ISFET和脲酶膜组成，其原理是利用pH-FET检测脲酶水解尿素时溶液pH发生改变。 第81页 第82页83 尿素传感器也可采取差动结构，使用两个FET，一个是固定有尿素酶FET ，另一个则是没有固定尿素酶FET，作为参比FET，利用运算放大器组成反馈电路。 Ag/AgCl电极可使溶液电位保持一定。第83页84第84页85

18、 测定时因为脲酶催化尿素反应时造成溶液中pH发生改变，从而造成溶液-界面上界面电位改变，经差动放大器后，输出电压与待测溶液尿素浓度相关。第85页86其它应用： 青霉素-FET L-谷氨酸-FET传感器第86页874.3 酶热敏电阻传感器 酶热敏电阻传感器是由固定化酶和热敏电阻组合而成。 用酶热敏电阻测定待测物含量是依据酶促反应产生热量多少来进行。经过温度改变推测待测物含量。第87页88酶热敏电阻基本组成密接型柱式反应器型第88页89酶热敏电阻测温方式第89页酶热敏电阻测量系统 第90页91酶载体特点： 机械强度高，耐压性好； 固定化效率高； 化学及生物学稳定性高。当前，载体除多孔玻璃以外，还有

19、多糖类凝胶或尼龙制毛细管等。第91页92优点： 容量小、响应快、稳定性好、使用方便、价格廉价。 第92页934.4 光纤光学型酶传感器高锟生于1933年，取得诺贝尔物理学奖“光纤之父”第93页94光纤传感器组成：光纤生物敏感膜（探头）光电换能器第94页(c)单束光纤，生物敏感膜与光纤为一体生物敏感膜(a)双束光纤 (b) 单束光纤， 生物敏感膜在端部光纤生物传感器信号转换器三种结构第95页光纤光学生物传感系统 第96页1.光纤生物传感器特点 抗干扰能力强，不受电磁场干扰； 不用参比电极，能够微型化； 实现远距离遥测； 响应速度快，灵敏度高。第97页2. 光纤酶传感器工作原理 待测物质从样品溶液

20、中扩散到生物敏感膜时，在固定化酶催化下生成一个待检测物质； 当底物扩散速度与催化产物生成速度达成平衡时，即可得到一个稳定光信号，依据光信号大小与底物浓度函数关系，得到底物浓度，普通情况下光信号大小与底物浓度成正比。第98页3. 光纤酶传感器分类 按照换能器能量转换方式不一样，分为化学发光型、光吸收型、荧光猝灭型、指示剂型和生物发光型。第99页（1）化学发光型 一些化学反应伴随光子释放，释放光子即化学发光强度与待测物浓度呈线性关系。 但有些生化反应不能释放光学信号，需要引入中间物，使其转变成能进行光检测信号。 第100页 鲁米诺（luminol）（3-氨基-邻苯甲酰肼），又称发光氨、光敏灵。在碱性条件下能被许多氧化剂（比如H2O2，ClO-等）氧化而发出蓝色光，是研究最早、最多、应用最广泛发光试剂。第101页谷氨酰胺 谷氨酸+NH3谷氨酸+O2+H2O 酮戊二酸+H2O2+ NH3鲁米诺+ H2O2 氨基邻苯二甲酸+N2+h谷氨酰胺酶谷氨酸氧化酶第102页鲁米诺+ H2O2 氨基邻苯二甲酸+N2+h第103页 GOD氧化葡萄糖，生成过氧化氢开启鲁米诺电化学发光，并经过光纤传感器检测发光信号。酶促反应和发光反应同时发生，所以传感器响应非常快。鲁米诺+ H2O2 氨基邻苯二甲酸+N2+h第104页（2）光吸收型 假如被测物A不含有光学