细胞毒性试验总结

1、细胞毒性实验总结 TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark2 o Current Document 抗HBV药物细胞毒性实验背景知识 1 HYPERLINK l bookmark4 o Current Document 细胞毒性实验方案的确立 3 HYPERLINK l bookmark6 o Current Document 细胞毒性实验方法稳定后的部分数据 4 HYPERLINK l bookmark8 o Current Document 细胞毒性实验质量评价指标 5 HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 细胞毒性

2、实验 SOP6（一）目的6 HYPERLINK l bookmark15 o Current Document （二）适用范围6 HYPERLINK l bookmark17 o Current Document （三）责任人6 HYPERLINK l bookmark19 o Current Document （四）规 程6试验准备7试验操作8数据处理和分析8 HYPERLINK l bookmark21 o Current Document 总结9一、 抗HBV药物细胞毒性实验背景知识细胞毒性是化学物质（药物）作用于细胞基本结构和/或生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细

3、胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程， 导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱，所引发的不良反应。按作用机制可分3种类型：基本细胞毒性，涉及一种或多种上述结构或功能的改变，作用于所有类型的细胞；选择细胞毒性， 存在于某些分化细胞上，主要通过化学物质的生物转化，与特殊受体结合或特殊的摄入机制所 引发；细胞特殊功能毒性，对细胞结构和功能损伤轻微，但对整个机体损伤非常严重。类似 毒性作用可通过细胞因子、激素和递质的合成、释放、结合和降解影响细胞与细胞间的交流或 特殊的转运过程而实现。毒性作用也可能来自化学物质对细胞外过程的干扰，任何一种非动物检测系统对多种因素都应加以考虑。1983年

4、Ekwall提出 基本细胞功能”的概念，即多数化学物质毒性作用是对细胞功能的非特异性损伤，却可引起器官功能的特异性改变甚至机体死亡。有 研究显示化学物质体外细胞毒性与其引起的动物死亡率及人体死亡的血药浓度之间都存在良好 的相关性。化学物质产生的损伤和死亡，最终可表现为细胞水平上的改变，由此推测体外细胞 毒性可以预测体内急性毒性。体外方法有助于预测化学物质急性暴露引发的全身和局部影响， 并评估体内毒性浓度。目前较为理想的抗 HBV药物有拉米夫定（3TC）、恩替卡韦（ETV）等。3TC是核昔左旋 对味体，早期用于艾滋病的治疗。 拉米夫定体外能才制艾滋病毒1、2型及乙型肝炎病毒逆转录酶，在人淋巴细胞

5、和单核细胞内抑制艾滋病毒逆转录酶活性，在 HBV-DNA转染的人肝癌细胞 内有抑制HBV-DNA复制，在HBV感染黑猩猩体内有抑制病毒作用。拉米夫定作用原理是药物进入细胞器，为细胞脱氧胞喀咤激酶和细胞激酶磷酸化为活性5-三磷酸拉米夫定，竞争性抑制依赖于病毒 DNA和RNA逆转录酶。恩替卡韦（ETV）为环氧羟碳脱氧鸟昔，具有较强的抗 HBV作用，也可抑制拉米夫定引起的YMDD变异病毒株感染。在体外应用HBV DNA转染的HepG2细胞作药敏试验， 结果该药抗HBV作用最强。恩替卡韦？拉米夫定？泛昔洛韦抑制 HBV 的半数有效浓度（EC50）分别为0.00375 mol/L 0.116科mol/L

6、（文献报道多在几 nM到几个 眼, 范围较宽）、100科mol/L在土拨鼠肝炎病毒（ WHV）感染的土拨鼠动物模型，口服恩替卡韦 0.1 mg/kg.d共12周，血清 WHV转阴。以后，每周口服 0.1 mg/kg ,血清 WHV仍维持阴性。因 此3TC和ETV常被用作抗HBV药物筛选时的阳性对照药，用来评价筛选系统的正常与否。3TCETV通常的做法是：将不同浓度的3TC加入到培养的细胞中，作用一定时间后检测药物对细胞的毒性。检测方法有 MTT法、XTT法、荧光检测法等。其中 MTT法和XTT法原理相同，由 于其方法简单快速，不需特殊的仪器设备，因此得到了广泛应用。MTT法是二十世纪八十年代发

7、展起来的一种快速、简便的测试方法，目前已被广泛用于药物体外筛选实验。MTT法是一种检测细胞活性的方法。与以往细胞水平研究中检测细胞活性的两种常规方法-细胞计数法和同位素掺入法相比，MTT法具有操作简便、快速、准确、廉价及不使用同位素等优点，已广泛应用于生物医学的诸多领域。同时，MTT法也是FDA及我国药品审批部门推荐的检测方法之一。其基本原理如下：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够还原黄色的澳化3-（4,5- 二甲基曝陛-2）-2,5- 二苯基四氮陛3-（4,5-dimethylthiazol-2yl）-2,5-diphenylterazolium bromide , MTT为蓝紫色的不溶于水的

8、甲月赞（formazan）,甲月赞的生成量在通常情况下与活细胞数成正比。由于甲月费的多少可通过酶标仪测定其在570nm处的吸光度（OD值）而得知，因此可根据OD值推测出活细胞的数目，从而了解药物抑制或杀伤细胞的能力。目前已有 MTT的升级替代产品，如 XTT、MTS、WST-8等，三种方法的比较见下表。尽管CCK-8方法简便、准确、灵敏度高，但比MTT的价格要贵不少，所以一般来说，还是 MTT法用的多。三种方法的比较MTT法XTT法CCK-8 法（WST-8法）甲月赞水溶性难溶性水溶性水溶性检测波长490 nm450nm450nm性状粉末2瓶溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用毋需顶制使

9、用有机溶剂DMS诚其它溶剂一一方便性+检测速度+重复性+稳定性+工作量-对细胞毒性-对人体毒性一-二、细胞毒性实验方案的确立在确定MTT法作为细胞毒性实验的方法之后， 我们对实验中可能涉及的各个参数进行了摸 索和优化。最初，由于一切都是未知，因此常常几个参数一起调整，使得各个参数对结果的影 响不是很清楚，走了一些弯路。后期逐渐摸清了参数对结果影响的权重，实验方案逐步确立。考虑的实验参数有： 细胞批次、细胞密度、孵育时间、加药次数、MTT量、MTT孵育时 间、DMSO溶解时间（振荡时间）等 。parameterCC50cell density2000/well, 5000/well, 10000

10、/well,40000/wellseeding time1d/2dincubation time7d/10dFBS10%, 2%, 0.5%volume100 山 150d , 180 d经过实验，最终将实验参数确定如下:parameterCC50cell density5000/wellseeding time1dincubation time7dFBS2%volume1804其中，孵育时间采用 7天，主要是希望缩短筛选周期，10天也取得了较好的结果。培养基体积对结果影响不大。采用180 M主要是和DNA增殖抑制实验保持一致。三、细胞毒性实验方法稳定后的部分数据在细胞毒性实验方案稳定之后，在

11、各孔吸光度的标准差、变异系数和各孔抑制率的标准差 都可以控制在很低的水平，表明该实验方案是稳定的，具有良好的重现性。Date:09/07/07compound: ETV cell density:5x103 incubation time: 7 drug adding:2 times2%FBS180ul1# plateCC50= 40.4uMConc.(uM)Date:09/07/07compound: ETV cell density:5x103 incubation time: 7 drug adding:2 times2%FBS180ul1# plateCC50= 40.4uMConc.

12、(uM)value1value2value3MeanSTDEV%CV% Viability%STDEV20020.2150.0178.01911.6410.1601000.3690.0215.73620.0110.493500.8580.0252.91146.5292.720251.2270.13510.96766.5409.9491.4800.0674.50480.2780.3201.6200.0684.17987.8340.0511.7400.0522.98994.3420.05701.8440.0422.251100.0000.000典型ETV的CC50实验数据0.25 0.5 I 2

13、J r IB 那国 12S 期 M2 1口？4 的43ETV (UM)典型3TC的CC50实验数据Date:09/07/07compound: 3TC cell density:5x103 incubation time: 7 drug adding:2 times2%FBS180ul2#plateCC50= 2130uMConc.(uM)value1value2Date:09/07/07compound: 3TC cell density:5x103 incubation time: 7 drug adding:2 times2%FBS180ul2#plateCC50= 2130uMConc

14、.(uM)value1value2value3MeanSTDEV%CV% Viability%STDEV80000.2090.03918.81511.7961.9024000720.0193.23832.3351.73920000.8420.0505.99447.5984.99010001.3070.0151.11173.8843.0565001.5880.0342.16689.7684.9662501.6480.0090.52993.1602.7951251.7100.0613.57196.6460.24101.7690.0170.934100.0000.000川SOcompound 3TC

15、 cell density 5x103 Incubation lime 7 drug addin* times 2% FBSrate=i CC50=2i30uM3254126250512 1QZ4 204-6 40915 192 16334 327003TC uM四、细胞毒性实验质量评价指标对细胞毒性进行质量评价白指标初步定为以下7个：. OD平均值：反映复孔间 OD值的平均水平，OD值越大，细胞数越多。.复孔OD值间的标准差（STDEV）:反映各复孔 OD值之间的离散情况。标准差越大， 说明复孔间不平行性越大，操作误差越大。.复孔OD值间的变异系数（CV）:也是反映复孔间 OD值离散情况的指

16、标。由于 OD 值间的标准差（STDEV ）的单位和OD的单位是一致的，不能体现离散的权重，因此 引入变异系数（CV）。这一指标以百分比的形式表现OD值的离散情况，形象、直观。.存活率（% Viability ）：计算各药物浓度下细胞的存活率可以反映细胞存活情况，该值 越大，说明药物的细胞毒性作用越小。.存活率的标准差（ STDEV ）:该值反映如以每个复孔均作为单独的实验，则同批的 复孔可以看作数批实验， 此时存活率的分布情况。 该指标越大，说明复孔间越不平行。.存活率的变异系数（ CV）:该指标反映各复孔间存活率的离散情况，该值越大，说明说明每一列细胞孔（即一系列稀释单孔）间不平行性越大。

17、. 半数致细胞毒性浓度（concentration of cytotoxicity 50% , 0050）:指对半数细胞产生 毒性作用所需浓度。该指标可用来反映实验系统是否正常工作及评价未知药物对细胞 的毒性。五、细胞毒性实验SOP化合物抗HBV活性细胞毒性实验标准操作规程（MTT法）（一）目的使实验操作标准化，保证正常工作的进行。（二）适用范围本标准适用于 MTT法检测抗HBV药物细胞毒性的操作及计算0050 o（三）责任人分子生物学组操作人员对本规程负责。（四）规程术语：0050 （ concentration of cytotoxicity 50 %）:半数细胞毒性浓度，指对半数细胞产生

18、毒性作 用所需浓度。在本实验中，指致50%细胞死亡所需的药物浓度。本实验旨在通过 MTT法检测未知化合物对转染了HBV基因组的细胞系HepG的细胞毒性。背景知识：MTT法是二十世纪八十年代发展起来的一种快速、简便的测试方法，目前已被广泛用于药物体外筛选实验。其基本原理如下：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够还原黄色的澳化3-（4,5-二甲基曝口坐-2）-2,5-二苯基四氮口坐3-（4,5-dimethylthiazol-2yl）-2,5-diphenylterazolium bromide, MTT为蓝紫色的不溶于水的甲月赞（formazan）,甲月赞的生成量在通常情况下与活细胞数成正比。由于甲

19、月费的多少可通过酶标仪测定其在570nm处的吸光度（OD值）而得知，因此可根据 OD值推测出活细胞的数目，了解药物抑制或杀伤细胞的能力。MTT法是一种检测细胞活性的方法。与以往细胞水平研究中检测细胞活性的两种常规方法-细胞计数法和同位素掺入法相比，MTT法具有操作简便、快速、准确、廉价及不使用同位素等优点，已广泛应用于生物医学的诸多领域。同时， MTT法也是FDA及我国药品审批部门推荐 的检测方法之一。试验准备试剂和耗材：试剂：胎牛血清（FBS） ; G418; DMEM 培养基（高糖）； 0.25%Trypsin-EDTA ;磷酸 盐缓冲液（无车镁）； DMSO ;耗材：0.2针头过滤器（有

20、机相和水相）；1 ml和10 ml注射器；96孔细胞培养板；移液管（5 ml、10 ml）;移液器Tip头。溶液配制：完全培养基：DMEM和FBS按9 ： 1 （体积比）混和，并添加1/1001/50 （体积比）的hepes 和终浓度为380回/ml的G418。维持培养基：DMEM和FBS按49： 1 （体积比）混和，并添加 1/1001/50 （体积比）的 hepe环口终浓度为3800ml的G418。磷酸盐缓冲液（无钙、镁）：8 g/L NaCl ,0.2 g/L KCl , 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH 2P。4, pH7.4,高压蒸汽灭菌121c 20 mi

21、n, 4c保存。（注意：实际配制时，有些试剂含多个 分子的水，需将该部分的质量算进去。）细胞培养：HepG培养采用完全培养基，于 37 C, 5%CO2细胞培养箱培养。接种时，细胞 密度控制在1X105/ml2X105/ml左右。细胞计数：见附件细胞计数。细胞铺板：细胞计数后，用完全培养基稀释成M04 ml,在5%CO2, 37c培养24 h备用。注意：在向96孔细胞培养板中接种细胞时，应注意每次吸取细胞悬液前，都应轻轻摇匀，尽量减少每次吸取的细胞数目的差异。将药物用少量DMSO溶解，并用0.2科订次性针头过滤器（有机系）过滤除菌，此为母液 （其浓度通常为预先设计的最高待测浓度的1000倍或以

22、上）；然后用维持培养基将母液稀释到实验预先设计的最高待测浓度。如配制的母液体积过小（如低于1 ml）,不便于过滤，可先用完全培养基将其稀释到最高待测浓度，再用0.2科厂次性针头过滤器（水系）过滤后分装备用。试验操作药物稀释：药物采用倍比稀释。可在 EP管中稀释。第一管为最高待测浓度的药液。自第二管分别加入一定量的维持培养基，然后从第一管吸取等量的药液至第二管，吹打混匀后,弃去tip头并换新tip头，从第二管吸取等量药液至第三管，吹打混匀。依此操作直至倒数第二管。最后一管为维持培养基，不含药物。药物处理：弃去细胞培养液，注意吸除干净。然后吸取已稀释的药液180出睢IJ对应的细胞孔中。各浓度组均设三孔重复，最后一排孔为细胞对照。另设培养基对照。如图1。加药后在5%CO2, 37c细胞培养箱培养72 h;按上述步骤换新鲜含药培养基，共2次。最后一次换药后再培养 72 h,准备检测。00000000 00000000 。 ooeoeeeo 。 。 。 oeeeeeeo ooooooeo 00000000图1黄色部分为PBS,无细胞；绿色为培养基对照；粉色、蓝色部分为两种不同的药物处理，每种药物设三个重复，8个浓度，红色部分为细胞空白对照。MTT检测：将MTT母液（5mg/ml , 10X）用PBS稀释为1 X）。去除各孔中的培养液（注 意：尽可能去除干净！），加入 1XMTT, 2