生物技术在食品检测中的应用

1、第八章 生物技术在食品检测中应用分子生物学技术免疫学技术生物技术在食品检测中的应用第1页第一节 PCR基因扩增技术一、PCR技术及PCR仪生物技术在食品检测中的应用第2页二、PCR检测技术原理和步骤提取样品DNA模板，依据待测物特异基因设计引物，按一定程序进行PCR扩增，然后检测扩增产物中是否含有待测物特异基因以确定样品是否含有待测物。生物技术在食品检测中的应用第3页食品相关待测物特异基因（含有特异性，高度保守区域）：微生物抗原基因、重复序列、rRNA基因如：沙门氏菌16SrRNA基因555bp 李斯特菌毒力基因hlyA743bp 金黄色葡萄球菌肠毒素B基因 志贺菌侵袭性质粒抗原H ipaH

2、基因 双歧杆菌16SrRNA基因转基因食品中特定开启子、终止子、标识基因、目标基因生物技术在食品检测中的应用第4页检测扩增产物中是否含有待测物特异基因：凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳核酸探针杂交判定法限制性内切酶分析DNA序列分析生物技术在食品检测中的应用第5页PCR技术用于检测时其主要步骤为: 设计并合成引物：长度以15 30个碱基为宜;利用化学伎俩对目标DNA 进行提取; 进行PCR 扩增;扩增产物分析判定：电泳最惯用，是否可见扩增特异区段DNA 带。生物技术在食品检测中的应用第6页三、实时荧光定量PCR技术 （ Real-Time Quantitative PCR ）定义：

3、在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析方法。生物技术在食品检测中的应用第7页与普通PCR区分普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增指数期对起始模板进行定量。生物技术在食品检测中的应用第8页生物技术在食品检测中的应用第9页Ct值（ threshold cycle ）：扩增产物荧光信号到达设定阈值时所经过扩增循环数。此时扩增是呈对数期增加。Threshold of detectionfluorescent signalPCR cyclesreal-time PCR ampli

4、fication plots (5 x 2-fold dilns. + NTC)50002500125020,00010,000End point detectionLow Ct( high copy #)high Ct( low copy #)log X0= -log(1+Ex) *Ct+ log MLog X0与Ct呈线性关系，依据样品扩增Ct值就可计算出样品中所含模板量。生物技术在食品检测中的应用第10页生物技术在食品检测中的应用第11页实时荧光定量PCR方法介绍：DNA 产物荧光标识 非特异性荧光标识 特异性荧光标识TaqManSYBR Green生物技术在食品检测中的应用第12页生物

5、技术在食品检测中的应用第13页融解曲线扩增反应完成后，经过逐步增加温度同时监测每一步荧光信号来产生溶解曲线，伴随反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态造成荧光信号降低，用荧光信号改变负一次导数与温度作图所得曲线。 单一峰：无非特异性荧光，定量准确有杂峰：其它产物出现非特异性荧光，所以定量不准确。生物技术在食品检测中的应用第14页PCR反应体系建立及优化SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物特异性高，不然扩增有杂带，定量不准MgCl2浓度:能够降低到1.5mM,以降低非特异性产物反应Buffer 体系优化反应温度和时间参数:由

6、酶和引物决定其它与常规PCR相同生物技术在食品检测中的应用第15页SYBR Green法优缺点 优点对DNA模板没有选择性适合用于任何DNA使用方便无须设计复杂探针非常灵敏廉价 缺点轻易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但能够经过融解曲线分析，优化反应条件对引物特异性要求较高生物技术在食品检测中的应用第16页方法2TaqMan法TaqMan水解型杂交探针5-端标识有汇报基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等3-端标识有荧光淬灭基团(Quencher, Q)探针完整，R所发射荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光。Taq酶有53外切核酸酶活性，可水解探针。生物技术在食品

7、检测中的应用第17页TaqMan法工作原理RQforward primerreverse primer33553551. PolymerisationprobeRQ33553552. Strand displacementQ33553553. CleavageR3553554. Polymerisation completedQRR = ReporterQ = Quencher3生物技术在食品检测中的应用第18页TaqMan法PCR反应建立1、引物、探针设计： 探针Tm为68-70，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽可能靠近探针，扩增片段80， B/T 抗原损伤。比放射性：单

8、位化学量标识物中所含放射性强度. 惯用Ci/g、mCi/mg、Ci/mmol等单位表示。比放射性 方法更灵敏；过高辐射自损伤大，对标识物免疫活性影响大，储存稳定性差。生物技术在食品检测中的应用第63页（五）、放射免疫测定技术步骤1.抗原抗体反应：平衡法或非平衡法2.分离结合与游离标识物沉淀剂沉淀复合物，离心分离。如第二抗体沉淀法、聚乙二醇沉淀法或活性炭吸附法等。要求：分离彻底，快速；分离试剂和过程不影响反应平衡；操作简便，重复性好且经济。3.放射性测定及数据处理晶体闪烁计数仪(射线)或液体闪烁计数仪( 射线)绘制标准曲线，计算待检抗原浓度。生物技术在食品检测中的应用第64页（六）、放射免疫在食

9、品中应用不但能够检测经食品传输细菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生虫，还可测定小分子量和大分子量物质，在食品检验中应用极为广泛在食品农药残留检测中应用生物技术在食品检测中的应用第65页五、单克隆抗体技术在食品检验中应用（一）、单克隆抗体基本概念经过B细胞杂交瘤技术, 取得特异性针对某一个抗原决定簇细胞克隆，产生均一性抗体.生物技术在食品检测中的应用第66页（二）、单克隆抗体技术基本原理要制备单克隆抗体需先取得能合成专一性抗体单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。而试验发觉骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫淋巴细胞二者合二为一，得到杂种骨髓瘤细胞即杂交瘤细胞

10、。生物技术在食品检测中的应用第67页生物技术在食品检测中的应用第68页（三）、单克隆抗体技术在食品中应用单克隆抗体在食品检测中最大优点是特异性强，不易出现假阳性，在食品检验中含有辽阔应用前景。当前，人们已经制备出了各种经食品传输和引发食物中毒细菌及毒素，真菌毒素，病毒、寄生虫、农药、激素等单克隆抗体，并建立了检测方法。生物技术在食品检测中的应用第69页六、胶体金免疫层析技术免疫层析法：滴加在膜一端样品溶液受膜毛细管作用向另一端移动，移动过程中被分析物与固定在膜上某一区域受体（抗原或抗体）结合而被固相化，无关物质则越过该区域而被分离，然后经过标识物显色来判定结果。以胶体金为标识物免疫层析技术称为

11、胶体金免疫层析技术（GICA）。生物技术在食品检测中的应用第70页生物技术在食品检测中的应用第71页生物技术在食品检测中的应用第72页生物技术在食品检测中的应用第73页生物技术在食品检测中的应用第74页生物技术在食品检测中的应用第75页连接垫：生物技术在食品检测中的应用第76页生物技术在食品检测中的应用第77页生物技术在食品检测中的应用第78页例：早孕试纸生物技术在食品检测中的应用第79页例：HIV试纸生物技术在食品检测中的应用第80页食品快速检测卡多用此原理金标单克隆抗体“瘦肉精”蛋白偶联物 二抗生物技术在食品检测中的应用第81页包括该部分试验豆瓣曲中黄曲霉毒素快速测定 生物技术在食品检测中

12、的应用第82页黄曲霉毒素B1快速检测试纸卡北京华安麦科生物技术有限企业生产。检测样品包含粮食、饲料、食用油等。样品制备：取粉碎均匀样品2.0g于离心管中，加2.0mL 和4.0mL 密封振荡5min，离心取上清液。 生物技术在食品检测中的应用第83页注意事项: 1、检测卡请在保质期内一次性使用； 2、使用前将检测卡和待检样本恢复至室温； 3、检测时防止阳光直射和电风扇直吹； 4、尽可能不要触摸检测卡中央白色膜面； 5、样品滴管不可混用，以免交叉污染； 6、假如提取液偏酸或偏碱，需要调整pH至中性后再检测； 7、遇油脂含量较高饲料，在加水溶解吹干样品时，静置分层，取下层液体检测； 8、离心后上清液取出不足2ml时，能够取出1ml吹干，随即加入水量为用量表中体积二分之一。检测限不变； 9、试验碰到任何问题，请与供给商联络。 生物技