黄水芽胞杆菌抗逆性潜力挖掘及乙醇耐受机制分析

1、黄水芽胞杆菌抗逆性潜力挖掘及乙醇耐受机制分析浓香型白酒是中国白酒典型代表之一，市场份额占全国白酒总量的70%以上1。根据GB/T 10781.12022 浓香型白酒，浓香型白酒以粮谷为原料，经传统固态发酵、蒸馏、陈酿、勾兑而成，未添加食用酒精及非白酒发酵产生的呈香物质，以已酸乙酯为主体复合香。微生物在白酒酿造过程中发挥重要作用，处于核心地位，能够产生多种生物酶和香味成分及其前体物质，参与淀粉糖化、酒精发酵、产酯生香等生化过程，对白酒独特风味的形成具有重要作用2。抗逆性是酿造微生物适应白酒发酵过程、发挥功能特性的基础。芽胞杆菌是白酒发酵过程中大曲、窖泥和酒醅中的优势类群，在大曲发酵的中后期开始大

2、量繁殖，并成为优势种群。与其他微生物相比，芽胞杆菌除具有产生生物酶、氨基酸、风味物质等代谢物功能特性外，通常具有耐酸、耐盐、耐高温、耐胆盐等显著特征3-4，以适应复杂多变的发酵生产环境。黄水是固态发酵生产浓香型大曲酒的副产物，为棕黄色黏稠液体，含有多种酸类、醇类等呈香味物质以及经过长期驯化的有益微生物5。实验室前期从四川省宜宾地区传统发酵浓香型白酒的黄水样品中分离到1株黄水芽胞杆菌(Bacillusaquiflavi)3H-106，具有较好的产蛋白酶活力，可产生苯甲醛、正丁醇、已酸乙酯等多种代谢风味物质，且通过全基因组测序分析显示，菌株在抗生素耐药性、产毒与致病性方面风险较低。本研究对黄水芽胞

3、杆菌3H-10进一步开展乙醇、酸、碱、NaCl和温度等耐受性潜力挖掘，并结合菌种全基因组序列分析解析菌种潜在耐受机制，为该菌株应用于浓香型白酒发酵的实际生产奠定理论基础。2.6 黄水芽胞杆菌3H-10乙醇代谢途径分析KEGG分析显示，菌株黄水芽胞杆菌3H-10基因组中含有1个乙醇脱氢酶基因adh和3个乙醛脱氢酶基因aldh，分别编码乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH), EC1.1.1.1和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH), EC.1.2.1.3，组成较完整的乙醇脱氢酶系(图2)。ADH和ALDH参与催化乙醇的分解代谢，乙醇通过A

4、DH氧化成为乙醛，乙醛通过ALDH氧化成为乙酸，乙酸进入柠檬酸循环，最终氧化成CO2和水。其中，ADH是乙醇代谢的重要限速酶之一，一般为以氧化型辅酶(NAD+)、氧化型辅酶II(NADP+)或吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，P)为辅酶的锌金属酶，具有广泛的特异性，是许多有机体中短链醇代谢的关键酶，可逆催化氧化短链醇、芳香醇等为相应的羧基化合物。ALDH是生物体内用于降解乙醛的重要酶类，以NADP+为辅酶的含锌类酶，催化包括乙醇在内的某些物质以及二级醇、醛和酮的脱氧反应。ADH和ALDH广泛存在于微生物、植物和动物体中，其代谢活性直接影响生物体内乙醇的代谢，从而对生

5、物体的生理状态产生直接影响。鞠建松等15将假坚强芽胞杆菌中adh和aldh进行克隆并异源表达，能够较大程度提高宿主对乙醇的耐受性。此外，黄水芽胞杆菌3H-10基因组中还含有1个乙醛脱氢酶(EC1.2.1.10)，可催化乙醛生成乙酰辅酶A，后者进入柠檬酸循环，协助促使乙醇代谢，最终氧化成CO2和水。图2 黄水芽胞杆菌3H-10中的乙醇代谢途径Fig.2 The alcohol metabolism pathway inB.aquiflavi3H-102.7 黄水芽胞杆菌3H-10乙醇耐受相关基因的定向检索目前关于芽胞杆菌乙醇耐受性的研究仍相对较少，微生物类群以枯草芽胞杆菌14-15为主。具有乙醇

6、耐受特性的微生物当前主要集中在酿酒酵母16-19、大肠埃希氏菌20-21和恶臭假单胞菌22等，其耐受乙醇的机制主要包括：(1)提高糖类和氨基酸等转运能力；(2)利用排出泵将有机溶剂排出细胞；(3)合成和积累海藻糖与脯氨酸等，减少膜的渗透性改变；(4)合成氨基酸等。将相关基因在黄水芽胞杆菌3H-10基因组中进行序列比对，结果显示该菌株不含有这些基因(表2)。说明上述机制不是黄水芽胞杆菌3H-10耐受乙醇的主要原因。表2 已报道的乙醇耐受相关基因在黄水芽胞杆菌3H-10基因组中的检测结果Table 2 The detection result of reported genes related w

7、ith alcohol tolerance in the genome ofB.aquiflavi3H-10芽胞杆菌作为白酒发酵过程中的重要微生物类群往往对乙醇等极端环境具有一定耐受性，对其机制的研究能够为菌株应用于实际生产奠定基础，值得深入探讨。本研究首次对我国四川省宜宾地区首株酿酒微生物新种菌株黄水芽胞杆菌3H-10乙醇耐受机制进行解析，为后续相关研究提供了参考。3 结论黄水芽胞杆菌3H-10是从浓香型白酒发酵样品黄水中分离的1株芽胞杆菌，具有显著的产蛋白酶和产风味物质能力，在抗生素耐药性、产毒与致病性方面安全性风险较低，在白酒发酵过程中具有较好的潜在应用价值。本文从乙醇、酸、碱、NaCl和温度等方面对黄水芽胞杆菌3H-10的抗逆性潜力进行挖掘，并探究其抗逆性潜在机制。结果显示，菌株可在4%乙醇环境生长，对乙醇具有一定耐受性。基因分析发现，菌株含有数量较多的HSP编码基因，可通过应激反应减弱乙醇对细胞的毒害作用；菌株基因组中含有完整的乙醇代谢途径相关