鼠伤寒沙门菌cya基因的克隆表达及生物信息学分析

1、第 鼠伤寒沙门菌cya基因的克隆表达及生物信息学分析.06.007开放科学(资源效劳)标识码(OSID):Cloning，ExpressionandBioinformaticsAnalysisofcyaGenefromSalmonellaTyphimuriumRUPenghui，LUXia，CHENYaohua，LIAOChengshui，YUZuhua，CHENGXiangchao，ZHANGChunjie某(TheKeyLaboratoryofAnimalDiseaseandPublicHealth，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang

2、，China)Abstract:TheaimofthisstudywastocloneandbioinformaticsanalyzecyageneofSalmonellaTyphimurium.cyagenewasamplifiedfromtheSalmonellaTyphimuriumSL1344strainbyPCRandthesequencewasclonedintopET-32a(+)vectorforexpressioninEscherichiacoliBL21(DE3)cellsandinducedbyadditionof1mmol/LIPTG.Atthesametime,onl

3、inebioinformaticssoftwarewasusedtoanalyzeitsbioinformatics.TheresultsshowedthatcyagenefromSalmonelaTyphimuriumwas1185bp.SDS-olecularweighZofCyaproteinwas44.97ku，themolecularformularwasC2023H3146N562O578Sn，andtheisoelectric收稿日期：2023-10-27基金工程：河南省自然科学基金工程(8)作者简介:茹鹏辉(1998-)，男，河南漏池人，硕士生，研究方向：人兽共患病的诊断和防治

4、,E-mail:penghui_ru163 通信 张春杰(1964-)，女，河南洛阳人，博士，教授，硕士生导师，研究方向：动物疫病防控和分子免疫学,E-mail:cjzhangsina 茹鹏辉等：鼠伤寒沙门菌cya基因的克隆表达及生物信息学分析6期1949point(pI)berofnegativelychargedresidues(Asp+Glu)andpositivelychargedresidues(Arg+Lys)were43and42,respectively.Cyaproteinwasamembraneproteinwithoutsignalpeptideandtransmembr

5、aneregion,containing4N-glycosylationsites,1O-glycosylationsites,27phosphorylationsites,13linearB-cellepitopesand11T-cellepitopes.ThesecondarystructureofCyaproteincontainedalphahelix(38.07%),extendedchain(19.80%),betaturn(5.58%)andrandomcoil(36.55%).Theresultslaidafoundationforfurtherstudyonthefuncti

6、onofCyaproteinofSalmonellaTyphimuriumandtheestablishmentofanimmunoassaymethodusingCyaproteinasantigen.Keywords:SalmonellaTyphimurium；cyagene；prokaryoticexpression；bioinformaticsanalysis鼠伤寒沙门菌(SalmonellaTyphimurium)是生物科技；DNA凝胶回收试剂盒购自康宁公共卫生学上具有重要意义的人兽共患食源性致病生命科学(吴江)；鎳柱亲和层析蛋白纯化菌,该菌于1884年首次从猪的大肠中别离出来，是试

7、剂盒、TaqPCRMasterMix(2d,bluedye)均购食源性致病菌中比拟常见的一种，临床病症主要表自生工生物工程(上海)股份；丙基-硫12+。腺昔酸环化酶代半乳糖1(IPTG)购自Sigma公司；ECL显色液(adenylatecyclase,cya)是沙门菌重要的毒力调节购自武汉赛维尔生物科技；鼠抗His标签基因之一，可以调节沙门菌近50%包括毒力因子在单抗、HRP标记羊抗鼠IgG均购自上海碧云天生物内的基因转录3%在细胞中cya具有催化ATP形技%成的环腺昔酸(cyclicadenosinemonophosphate,1.3引物设计及合成某现出伤寒和肠胃炎等病症cAMP)与其受体

8、蛋白结合的能力，而cAMP与受体根据GenBank数据库中公布的鼠伤寒沙门菌蛋白(CRP)是细菌中存在的重要转录调节因子，其cya基因序列(登录号:&1)设计鼠伤寒沙中cAMP是所有负责调控的蛋白中最为重要的，对门菌cya基因所需的特异性引物，cya-F:5，-GAA-转录起始的调控到达了一半以上cya基因最AGCTA-3/(下早被发现是在阻遏大肠杆菌分解代谢的过程中，参划线处为BamHI酶切位点)；cya-R:5-CTA-与代谢调节系统，其突变株可以影响菌毛、鞭毛和代TTCCT-3(下划谢氨基酸的相关基因的表达研究说明，敲除线处为Hnd皿酶切位点)%引物由生工生物工程cya基因的鼠其力，有较

9、好的免疫原性，是较为理想的鼠伤寒沙门菌基成%()1.4PCR扩增及克隆因缺失候选疫苗毒株之一89%因此，本试验克隆分应用cya基因特异性引物，利用PCR技术对鼠析cya基因并实现其体外表达，以期为进一步研究伤寒沙门菌cya基因进行扩增%PCR反响程序:鼠伤寒沙门菌Cya蛋白的功能及建立以Cya蛋白95b预变性5min；95C变性30s,55C退火30s,为抗原的免疫鉴别检测方法奠定良好的根底%72C延伸40s,共30个循环；72C延伸10min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收后连接至pMD19-T载体，连接产物转化大肠杆菌1材料与方法DH5a感受态细胞，PCR鉴定和提取质粒酶

10、切鉴定1.1菌株、质粒、及表达载体正确后(命名为pMD19-T-cya),将菌株送至生工生鼠SL1344、pET-32a(+)、大肠杆菌DH5a和)感受态细胞均由河南科技大学动物疫病与公共卫生重点实验室保存;物1.5)程(进行测序%pET-32a-cya原核表达载体的构建与鉴定建确的pMD19-T-cya进行PMD19-T载体购自宝生物工程(大连)%BamHI和Hnd皿双酶切后连接至质粒pET-1.2主要试剂32a(+)，然后将携带有cya基因的原核表达载体限制性内切酶BamHI和Hnd皿、T4DNApET-32a-cya转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细连接酶、DNAMarker均购自

11、上海碧云天生物技术胞中，经PCR扩增和双酶切鉴定，构建cya基因原；质粒小量提取试剂盒购自北京康为世纪pET-32a-cya-BL21%1950中国畜牧兽医Cya蛋白的表达、纯化及Westernblotting检测16结2利用终浓度为1mmol/L的IPTG对重组菌48果cya基因的PCR扩增与克隆2.1pET-32a-cya-BL21进行诱导表达，37C诱导表达鼠伤寒沙门菌NA为模板，应用6h后12023r/min离心2min，收集菌体。加适cya基因特异性引物进行PCR扩增，电泳量PBS重悬，冰浴超声破碎30min后离心，分别收大小约1200bp的目的条带图1,与预期片段大纯对小相符%用的

12、样品进行加组质粒pMD19-T-cya进行双酶切鉴定，结果出现约入上样液1/1为4:1,煮沸10min后经SDS-2600bp的载体条带和约1200bp的目的条带图PAGE电泳观察Cya蛋白的表达。电泳在恒压条2。酶切鉴定正确后的pMD19-T-cya重组质粒经，用清层析进行纯化,的压为80V,时间约40min；分件下进行，浓缩胶压为120V，直到样品到离胶胶底部时%性内切酶BamH&、Hnd%对重，cya基因大小测序1185bp，GenBank中SL1344株cya基因相似性为的鼠100%。SDSpET-32a-cya-BL21M电泳后电转到PVDF膜上，PBST洗涤3次，12bp5min/

13、次，5%脱脂奶粉进行封闭过夜，参加1：1000稀释的抗His标签的抗体37C孵育2h，2023PBST洗涤3次。与1：1000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG结合23h,PBST洗涤3次，ECL显色后观嗪1.7序列相似性比对250查找NCBI中公布的十余种不同物种的Cya氨基酸类似物，利用Mega7.0分析丨Cya的相似性，并构建氨基酸序列的系统进化树%100M,NAMarker；1，ya基因PCR扩增产物；2,阴性对照1.8生物信息学分析M,NAMarker；1?PCRamplificationresultof利用PrimerPremier5.0软件将cya基因序列cyagene；2，Neg

14、ativecontrol翻译成氨基酸序列；利用ExPASy在线网站图1ProtParam ：$ AProtScale :$/protscale/Biotechhtp：基酸组edu/分别对蛋白分子质量性成、蛋白的bp$biotech3ou3性、氨基酸的00码子和的可溶性进行分析。利用NCBI在线网站 s：$./ASignalP和TMHMMprogramANetNGlyc、NetOGlyc和250NetPhos分别预测保守区域、跨膜区和信号肽、磷酸、N-基O-基；网站 ：$/bcell/； :$ cbs.dtu.dk/services/预测蛋白可能存在的线性B细胞抗原T细胞用NPSA网htps$npsa-rabbicpifr/cgbin/预测蛋白的i-；利用SWISS-MODELWorkspace在线网站预测蛋白的三级结构%100用在pMD19-T-cya的双酶切鉴定图2Fig.2DoubleenzymeidentificationforpMD19-T-cyapET-32a-cya重组质粒的构建与鉴定2.2挑取疑似pET-32a-cya重组质粒的菌落,提取质粒进行PCR和双酶切BamH&、Hnd%鉴定，泳可6000bp的的目的条带图3,与预期带1200bp相符，说