感染性疾病的微生物学诊断

1、感染性疾病的微生物学诊断感染性疾病的微生物学诊断2了解临床微生物学在感染性疾病中的应用熟悉常用的临床微生物学检测技术熟悉抗菌药物敏感实验原理及准则掌握细菌耐药机制及常见耐药表型教学目标4了解临床微生物学在感染性疾病中的应用熟悉常用的临床微生物学3一、临床微生物的应用5一、临床微生物的应用4Case study（1）女性，73岁，因手背部伤口不愈合来我院就诊；自述21天前被自家狗咬伤；外院门诊行清创术后5天，伤口内仍有脓性分泌物；初步诊断：手背狗咬伤，手背感染；初步治疗方案：盐酸头孢替安+硫酸依替米星联合抗感染治疗。6Case study（1）女性，73岁，因手背部伤口不愈入院后行清创术，采集脓

2、性分泌物进行培养第一次培养结果： 普通细菌培养：多杀巴斯德菌； 厌氧培养：未生长； 治疗前入院后行清创术，采集脓性分泌物进行培养 6Pasteurella multocida is a Gram-negative, nonmotile, coccobacillus belonging to the Pasteurellaceae family. It can cause avian cholera in birds and a zoonotic infection in humans, which typically is a result of bites or scratches from

3、 domestic pets. Many mammals and fowl harbor it as part of their normal respiratory microbiota, displaying asymptomatic colonization.8Pasteurella multocida is a Gr第二次培养结果： 普通细菌培养：多杀巴斯德菌； 厌氧培养：产黑普雷沃菌、梭杆菌梭杆菌 产黑普雷沃菌Anaerobic，Gram-negative bacteria第二次培养结果：梭杆菌 产黑普8药敏实验： 多杀巴斯德菌: 阿奇霉素 S 厌氧菌：甲硝唑 S治疗：阿奇霉素+甲硝

4、唑磷酸二钠治疗预后：经20余天治疗，患者病情平稳，皮肤向伤口内陷，无异常脓性分泌物。 治疗后10药敏实验： 治疗后9Question该病例应用了何种微生物检测技术？11Question该病例应用了何种微生物检测技术？10Case study（2）男性，45岁，自诉8小时前自3米高处坠落，致左肘及左腕部肿痛畸形，左腕部开放流血；外院行左腕伤口清创缝合术；为进一步治疗收入我院；初步诊断：左尺、桡骨远端开放性骨折，左尺神经损伤。12Case study（2）男性，45岁，自诉8小时前自11入院第一天，患者左手部活动感觉较前减退，查房完全松开石膏绷带，左腕部缝合创口未见红肿及渗出，毛细血管充盈试验正常

5、，入院后给予消肿药物和抗生素预防感染治疗。入院第二天和第三天，患者体温升高，最高达39，患部肿胀和入院时没有明显变化，继续对症观察治疗。入院第四天及以后，发现左手腕部出现大小水泡，前臂远端及手指皮肤青紫，手部感觉减退，决定手术切开检查。术中穿刺水泡内容物，发现液体黑暗、张力高、有恶臭味，涂片送检并取样进行细菌培养。13入院第一天，患者左手部活动感觉较前减退，查房完全松开石膏分泌物涂片结果：见到革兰阳性的粗大杆菌分泌物厌氧培养：产气荚膜梭菌 治疗前分泌物涂片结果：见到革兰阳性的粗大杆菌 治疗前13 产气荚膜梭菌Clostridium perfringens (formerly known as

6、C. welchii) is a Gram-positive, rod-shaped, anaerobic, spore-forming bacterium of the genus Clostridium.C. perfringens grows readily on blood agar plate in anaerobic conditions and often produces a zone of hemolysis. 15 产气荚膜梭菌14C. perfringens is ever present in nature and can be found as a normal co

7、mponent of decaying vegetation, marine sediment, the intestinal tract of humans and other vertebrates, insects, and soil. Clostridium perfringens is the most common bacterial agent for gas gangrene, which is necrosis, putrefaction of tissues, and gas production. It is caused primarily by Clostridium

8、 perfringens alpha toxin. The gases form bubbles in muscle (crepitus) and the characteristic smell in decomposing tissue. After rapid and destructive local spread (which can take hours), systemic spread of bacteria and bacterial toxins may result in death. This is a problem in major trauma and in mi

9、litary contexts. 16C. perfringens is ever prese15Question 以上两个病例的共同点，遇到类似患者应重视何种细菌的培养？17Question 以上两个病例的共同点，遇16深部外伤如车祸、挤压伤后，人或动物咬伤后的继发感染，均可能合并厌氧菌感染。分泌物有恶臭，或为暗血红色，并在紫外光下发出红色荧光，均可能是厌氧菌感染。感染组织局部产生大量气体：某些厌氧菌可产生大量气体，造成组织肿胀和坏死，皮下有捻发音，通常是产气荚膜梭菌感染的特征。1817Case study（3）女性，3岁，因左髋活动受限，疼痛4天，发热4天入院；检查：最高到T 39；WBC

10、: 13.64109/L，N:86.8%；CRP和ESR均升高既往史：1年前于外院行左腹股沟囊肿切除术；诊断：髋关节急性化脓性关节炎（左）；治疗：1、行左髋关节穿刺术，脓液培养 2、头孢曲松（罗氏芬）抗感染治疗19Case study（3）女性，3岁，因左髋活动受限，18穿刺液培养： 沙门菌属（Salmonella）20穿刺液培养：19药敏：亚胺培南（泰能）：S21药敏：亚胺培南（泰能）：S20Question从该病例中你得到了什么启示？22Question从该病例中你得到了什么启示？21Case study（4） 女性，73岁，2012年6月8日入院； 诊断：腰椎术后20天，伤口感染； 入院

11、后持续发热，最高到T：39； 检查：胸片：双肺胸腔积液； WBC: 13.64109/L，N:86.8%；CRP: 123mg/L(正常值8 mg/L)； ESR: 46mm；PCT: 0.72ng/mL (正常值0.1ng/mL)； G实验： 77.5pg/mL (正常值10pg/mL)； 治疗：万古霉素+头孢哌酮/舒巴坦抗感染,治疗效果不佳23Case study（4） 女性，73岁，2012年6痰涂片：上皮细胞25/LPF；G-杆菌（+）；类酵母菌（），假菌丝(+)痰涂片：23 痰培养：白色念珠菌光滑念珠菌铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌 尿培养：白色念珠菌 便培养：白色念珠菌、光滑念珠菌 分泌

12、物培养：屎肠球菌 血培养：荧光假单胞菌25 痰培养：24Question从该病例中你得到了什么启示？26Question从该病例中你得到了什么启示？25有念珠菌感染的危险因素：恶性肿瘤长期卧床、营养差插尿管广谱抗生素抗真菌治疗27有念珠菌感染的危险因素：26二、常用的临床微生物检测技术28二、常用的临床微生物检测技术27细菌染色 革兰染色；抗酸染色；墨汁染色细菌培养+鉴定+药敏 普通培养；厌氧培养真菌培养+鉴定+药敏血清学实验 29细菌染色28 临床常见微生物标本培养血标本培养 呼吸道标本培养尿及生殖道标本培养粪便标本培养脓液及分泌物标本培养无菌体液标本培养（脑脊液、关节液、胸腹水等）厌氧标本

13、培养30 临床常见微生物标本培养血标本培养 29血液感染是一种危重的全身感染，对其进行病原菌的检验，提供病原学的诊断极为重要。 血培养是诊断菌血症的基本而重要的方法，若从患者血液中检出细菌，一般视为感染，提示有菌血症。继发性感染 血培养 Blood Culture31血液感染是一种危重的全身感染，对其进行病原菌的检验，提供30“只有在发热时，才需要进行血培养。”血培养指征想采就采？32血培养指征想采就采？31怀疑血流感染或脓毒血症时，应常规做血培养 血流感染的症状及指征包括低血压或高血压WBC/CRP/PCT的升高严重的局部感染心率、呼吸频率异常加快不明原因的发烧或体温过低休克、寒战，僵直33

14、怀疑血流感染或脓毒血症时，应常规做血培养 血流感染的症状32“何时采血进行血培养，无特殊时间要求。”采血时机？34“何时采血进行血培养，无特殊时间要求。”采血时机？33Time (min)体温03060菌血症水平Chills寒战Blood Cultures血培养35Time (min)体温03060菌血症水平Chills34 “为减轻患者痛苦，只采一份血液标本即可。”采血套数？36采血套数？35血培养套数与阳性检出率（）6580969937血培养套数与阳性检出率（）6580969936“每瓶采集多少血液无特殊要求。”采血量？38“每瓶采集多少血液无特殊要求。”采血量？37导致血流感染的G-菌、

15、G+菌、厌氧菌及真菌，其血培养的阳性率均与采血体积相关阳性率标准体积：采血量为8-10ml,平均8.7ml;低体积：采血量3.5ml;平均2.7mlMermel LA, et al. Ann Intern Med. 1993;119:270-272.39导致血流感染的G-菌、G+菌、厌氧菌及真菌，其血培养的阳导管相关血流感染（CRBSI）Catheter related blood stream infection中心静脉导管:通常选择锁骨下静脉、颈内静脉和股静脉。经外周静脉置入中心静脉导管（PICC）：通常选择肘部的贵要静脉、正中静脉和头静脉。导管相关血流感染（CRBSI）Catheter

16、relate实验室（保留导管）一般情况取两份血，一套来自外周静脉，另一套来自导管内，两份血源的采血时间应接近且同时送检。实验室（保留导管）一般情况取两份血，一套来自外周静脉，实验室（不保留导管）从独立的外周静脉采两套血，同时在无菌状态下取出导管，剪下导管尖端5cm或近心端，一并送细菌室培养。实验室（不保留导管）从独立的外周静脉采两套血，同时在无菌状41下呼吸道感染是最常见的呼吸道感染症，主要指肺实质性炎症的肺炎和支气管黏膜炎症的支气管炎，是我国常见病和病死率高的感染性疾病。痰标本的细菌学检查对呼吸道感染的诊断有重要意义。支气管肺泡灌洗液（PBAL)支气管毛刷 呼吸道标本培养 Respirato

17、ry Culture43下呼吸道感染是最常见的呼吸道感染症，主要指肺实质性炎症的42送检指征下呼吸道感染患者可有发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，可伴有胸痛、气急甚至呼吸困难，肺部可闻及湿啰音。白细胞总数和中性粒细胞比例明显增高。X线检查肺部有炎症性浸润或胸腔积液等。44送检指征下呼吸道感染患者可有发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、43采集时间： 痰：一般以晨痰为好采集方法： 自然咳痰法：清水反复漱口后，用力咳出呼吸道深部的痰，将痰液直接吐入无菌容器中，标本量应2ml；无痰可用3-5NaCl 5ml雾吸约5min导痰 标本采集45采集时间：标本采集444645尿路感染：指大量微生物在尿路中生长

18、繁殖而引起的尿路炎症。 为最常见的感染性疾病，发病率约占人口的2%。多见于成年女性。尿路感染需要明确部位和急性与慢性，主要依病原菌检测。 尿培养 Urine Culture47尿路感染：指大量微生物在尿路中生长繁殖而引起的尿路炎症。46送检指征尿频、尿急、尿痛、排尿困难和耻骨上压痛肉眼脓尿或血尿尿常规检白细胞和（或）亚硝酸盐阳性留置导尿管的患者出现发热膀胱排空功能受损，有尿潴留48送检指征尿频、尿急、尿痛、排尿困难和耻骨上压痛47采集时间：晨起第一次尿液为佳采集方法： 中段尿采集法：女性：成年女性外阴部先以肥皂水清洗，再以无菌水冲洗，然后排尿弃去前段尿，留取中段尿10ml左右于无菌试管内送检；

19、男性：先用肥皂水清洗尿道口，后用清水冲洗，留取中段尿 标本采集49采集时间：晨起第一次尿液为佳 标本采集48 注意事项： 无菌导尿管采集尿液，应在排出15ml尿液后收集标本，但导尿容易引起逆行性感染留置导尿管采尿，应先以75%酒精消毒导管口，用无菌注射器收集5-10ml尿，长期留置导尿管患者，应在更换新尿管时留取尿标本50 注意事项：生殖道（Genital tract)标本：（1）子宫内分泌物：采集时避免阴道和宫颈口正常菌群污染（2）盆腔脓肿：用无菌注射器从子宫直肠凹陷处抽取脓液（3）前列腺液：按摩前列腺采集标本或前列腺活检组织做细菌培养注：怀疑淋球菌感染，取材标本应注意保温并及时送检49生殖

20、道（Genital tract)标本：5150入院诊断不是胃肠炎的患者不做常规粪便培养。一次粪便培养阴性不能完全排除胃肠道病原菌的存在。腹泻病人在发病早期（6h）内采集到的血便或液状便的效果最好。便培养主要针对感染性腹泻，如霍乱、沙门、志贺菌、副溶血弧菌等，住院3天以上发生抗生素相关性腹泻患者进行常规培养意义不大，可进行肠道菌群检测或难辨梭菌毒素检测。 粪便培养 Stool Culture52入院诊断不是胃肠炎的患者不做常规粪便培养。 51送检指征便涂片镜检白细胞5个/HP重症腹泻血便、脓液便未经抗生素治疗的持续性腹泻53送检指征便涂片镜检白细胞5个/HP52标本采集用药前自然排便，采集脓血、

21、黏液部分23g。外观无异常的粪便应从粪便的表面不同部位取材。液体便取絮状物12ml,置无菌容器内送检。如排便困难或婴幼儿患者，可用直肠拭子法采集标本。54标本采集用药前自然排便，采集脓血、黏液部分23g。535554由创伤、手术、侵入性器械操作等外科治疗引起的感染最为常见。细菌造成伤口感染一般认为需每克组织内细菌数量在105 106个以上。 脓液及分泌物培养 Wound and Abscess Culture56由创伤、手术、侵入性器械操作等外科治疗引起的感染最为常见55送检指征手术部位感染皮肤软组织感染和烧伤感染骨骼感染：骨髓炎、椎间盘感染57送检指征手术部位感染56标本采集 开放性脓肿：无

22、菌盐水或70%乙醇擦去表面渗出物，尽可能抽吸或将拭子深入伤口，用拭子深入溃疡基地部或边缘部，采集两个拭子分别做培养和革兰氏涂片染色。 封闭性脓肿：消毒局部皮肤或粘膜表面后，用注射器抽取，将脓液注入无菌试管内送检。 58标本采集 开放性脓肿：无菌盐水或70%乙醇擦去表面渗出物57大面积烧伤的创面分泌物：用无菌棉拭子取多部位创面的脓液或分泌物，置无菌试管内送检。由于烧伤的早期创面是无菌的，通过12小时才可出现大量细菌，因此在烧伤后12小时内，勿采集创面的标本，否则不能获得阳性结果。 59大面积烧伤的创面分泌物：用无菌棉拭子取多部位创面的脓液或58厌氧菌分布十分广泛，是体内正常菌群的组成成员，多为条

23、件致病菌；厌氧菌感染遍及临床各科，且多为混合感染 厌氧培养 Anaerobic Culture60厌氧菌分布十分广泛，是体内正常菌群的组成成员，多为条件致59标本采集与运送标本的采集与运送是否适当，对厌氧菌培养能否成功至关重要。采取标本时应尽量避免接触空气，多使用针筒抽取，减少标本与空气接触的机会。一般情况下，应从无正常菌群寄居的部位采取标本。61标本采集与运送标本的采集与运送是否适当，对厌氧菌培养能否60 无菌体液培养Sterile body fluid culture脑脊液、关节液、腹胸水、滑膜液、羊水、胆汁等培养标本。这些均由临床医生采样，采样后根据标本外观选择培养。明显炎性的标本可直接

24、注入无菌容器中送检，清或轻度混浊的标本可按血培养方法操作。62 无菌体液培养Sterile body flu61三、抗菌药物敏感实验63三、抗菌药物敏感实验62抗菌药物敏感实验 测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏感性实验（Antimicrobial Susceptibility Test），简称药敏实验（AST）。64抗菌药物敏感实验 测定抗菌药物在体外对病原微生物63药敏实验的意义预测抗菌治疗的效果；指导抗菌药物的临床应用；发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临床医生选择合适的药物，避免产生或加重细菌的耐药；监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染的

25、流行病学，以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。 65药敏实验的意义预测抗菌治疗的效果；64药敏实验的标准化CLSI：美国实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute)每年修订更改包括质控新药的判定标准特殊耐药性的检测66药敏实验的标准化CLSI：美国实验室标准化委员会(Cli65敏感性分类敏感（Susceptible，S）用常规用量治疗有效常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC 5倍以上。耐药（Resistance, R）用常规用量治疗不能抑制细菌的生长MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度67敏感性分类敏感（Suscept

26、ible，S）66中介 (Intermediate, I)MIC接近血、体液中药物的浓度，治疗反应率低于敏感株药物生理浓集部位有效 加大用药剂量可能有效缓冲区：防止操作的系统误差造成重大结果的判定错误剂量依赖敏感（Susceptible-dose dependent,SDD)高剂量使用该药仍然安全时，高剂量给药可能有效68中介 (Intermediate, I)67纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer，KB法），半定量药敏纸片抑菌环检测方法-169纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer，KB法），半定量68MIC法（minimal inhibitory concentration)稀释法(肉

27、汤、琼脂)自动化仪器法抗生素连续梯度法 (E-test )单位(ug/ml)检测方法-270MIC法（minimal inhibitory conc69肉汤稀释法：以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培养后观察其最低抑菌浓度。7170 自动化仪器检测美国BD公司 phoenix 100生物梅里埃公司 VITEK AMS6072 自动化仪器检测美国BD公司 phoenix 10071E test 法73E test 法72四、细菌的耐药74四、细菌的耐药7375747675多重耐药菌株全球广泛流行 Gram-negative Enterobact

28、eriaceae with resistance to carbapenem conferred by New Delhi metallo-lactamase 1 (NDM-1) are potentially a major global health problem.superbug77多重耐药菌株全球广泛流行 Gram-negat76细菌耐药原因-“成也萧何败也萧何”抗生素的筛选和诱导作用耐药菌传播速度增加农业、渔业和家禽养殖业中抗生素的添加78细菌耐药原因-“成也萧何败也萧何”抗生素的筛选和诱导作77耐药菌株被迅速选择和扩散个别细菌耐药xx耐药菌为主抗生素暴露 xxxxxxxxxx79

29、耐药菌株被迅速选择和扩散个别细菌耐药xx耐药菌为主抗生素78固有耐药性(intrinsic resistance )指细菌对某种抗菌药物的天然耐药性。来源于该细菌本身染色体上的耐药基因,代代相传,具有典型的种属特性。如，肠道杆菌对青霉素，铜绿假单胞菌对氨苄西林以及链球菌属对氨基糖苷类药物都属于固有耐药性。细菌的耐药性80固有耐药性(intrinsic resistance )79获得耐药性(acquired resistance) 是指细菌DNA的改变导致其获得耐药性表型。原先对药物敏感的细菌群体出现了对抗菌药物的耐药性多由质粒介导的耐药性。方式：transformation， transdu

30、ction， conjugation，transposition81获得耐药性(acquired resistance) 感染性疾病的微生物学诊断81 常见耐药表型及耐药菌-内酰胺酶(-lactamases )超广谱-内酰胺酶(extended-spectrum -lactamases )耐甲氧西林葡萄球菌（methecillin resistance staphylococcus，MRS）氨基糖苷类抗生素高耐药肠球菌(high-level aminoglycoside resistance strains to enterococcus )耐青霉素肺炎链球菌(penicillin resistance S.pneumoniae ,PRSP）83 常见耐药表型及耐药菌-内酰胺酶(-lactam82 常见耐药表型-内酰胺酶(-lactamases )：细菌产生的-内酰胺酶能水解-内酰胺类抗生素的-内酰胺环使酰胺键断裂而失去抗菌活性。临床意义： -