降香种子超低温保存技术规程

1、T/CSMA XXXX2018 PAGE 2降香种子超低温保存技术规程范围本标准规定了降香（Dalbergia odorifera T.Chen）种子超低温保存过程中的术语和定义、种子的选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等技术要求。本标准适用于降香种子的超低温长期贮藏。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.6 农作物种子检验规程 水分测定GB/T 3543.7 农作物种子检验规程 其他项目检验术语和定义下列术语和定义适用于本文

2、件。降香 Dalbergia odorifera T.Chen为豆科（Leguminosae）黄檀属（Dalbergia Linn. f.）乔木，高1015 m，小枝有小而密集的皮孔，圆锥花序腋生，国家级重点保护野生植物。为XX特有的珍贵树种，心材极耐腐，切面光，纹理美致，且香气经久不灭，是名贵家具、工艺品等上等木材；木材的蒸馏油香气不易挥发，可作定香剂；心材入药，具有降压、行气活血、止痛止血的功效，是中国药典（2015）收载的珍稀名XX药。 降香果实 Dalbergia odorifera T.Chen fruits果实为荚果，其荚果舌状圆形，长4.58 cm，宽1.51.8 cm，基部略被

3、毛，顶端钝或急尖，基部骤然收窄与纤细的果颈相接，果颈长510 mm，果瓣革质，有种子部分明显隆起，状如棋子，厚可达5 mm，有种子1（2）粒。降香种子 Dalbergia odorifera T.Chen seeds降香的播种材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子圆肾形，扁平，棕褐色，直径0.50.8 cm，表面光滑，种脐条形。种子超低温保存 seed of cryopreservation 指将经过前处理的降香种子置于液氮（-196）中保存。种子的选择果实采收 11月至12月，当荚果果皮由青绿色变为黄褐色至棕褐色时，即可采收，去除包裹种子的豆荚，取出种子。种子选择挑选发育饱满、均匀、

4、健康的种子，置于10 种子储藏柜中保存备用（存放时间不超过2个月）。种子前处理生活力检测参照GB/T 3543.7中的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法检测种子生活力。随机抽取30 粒种子，水浸20 h，剥去外层种皮，沿种脊小心将种子分成2 爿后放培养皿内，内侧面向下，滴入TTC 溶液浸没种子，室温（25 ）避光放置4 h 后观察染色结果。生活力计算直接用肉眼对染色结果进行观察鉴定。凡胚及胚乳全部染成有XX的鲜红色，且组织状态正常的，为有活力的种子；否则为无生活力的种子。计算：生活力=有活力的种子数/总的种子数100%待保存的降香种子生活力应80%。含水量范围用尼龙网袋包裹降香种子，置于

5、盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为9000:1，室温条件下干燥处理815 h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量由15%20%降至12%13%。参照GB/T 3543.6中的高恒温烘干法（130烘干1h）测定种子含水量（W0），W0=（鲜重-绝干重）/鲜重100%。种子保存量降香种子保存量不少于300粒，以便后期的活力检测使用。种子冷冻方式降香种子超低温保存的冷冻方式为玻璃化冷冻法，即将装有种子的5 mL冻存管（每管30粒种子）置于装载液（LS）中并于25 处理种子25 min，再用玻璃化保护溶液（PVS2）冰浴处理种子30 min，换上预冷新鲜的PVS2后迅速投入液氮中进

6、行超低温保存。恢复培养种子解冻处理液氮中至少冻存24 h后，取出1个冻存管，立即放入40 水浴中快速解冻5 min，而后用洗涤液（DS）浸泡15 min，并用纯净水洗涤3次。冻后种子生活力检测取出15粒解冻后的种子，参照5.15.2生活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力70%时视为保存成功。恢复培养将剩下15粒解冻后的降香种子，播种到带有无菌滤纸的带盖发芽盒中，温度25 28 ，湿度70% 85%条件下培养。降香种子出芽周期大概1030 d。附录1 TTC的配制和保存方法精密称取TTC 1.00 g，溶于100 mL磷酸盐缓冲液中，制成浓度为1%的TTC溶液，调pH至6

7、.57.5，置棕色瓶内4 冰箱备用。磷酸缓冲液配置方法：溶液I：9.08g磷酸二氢钾溶于1 L无菌水中；溶液II：35.81 g磷酸二氢钠溶于1 L无菌水中；I：II=2：3的比例混合制成磷酸盐缓冲液）2 装载液（LS）的配制及保存方法精密称取蔗糖13.7 g，称量甘油11.9 mL，溶于液体MS培养基中，调pH至5.8后定容至100 mL，高温高压灭菌，4 冷藏。 3 玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8 mL、乙二醇13.6 mL、二甲亚砜13.6 mL，称取蔗糖13.7 g，溶于MS溶液中，调pH至5.8后定容至100 mL，高温高压灭菌，4 冷藏。注意：配置时需戴

8、手套，并在通风厨内操作。 4 洗涤液（DS）的配制及保存方法精密称取蔗糖41.1 g溶于MS溶液中，调pH至5.8后定容至100 mL，高温高压灭菌，4 冷藏。 参考文献1 中国植物志委员会.中国植物志（第40卷）M. 科学出版社.2004（1994）:1142 国家药典委员会.中华人民共和国药典M.XX，中国医药科技出版社，2015，229-2303 Xu Langran. Chen Dezhao.Zhu Xiangyun et al. Fabaceae（Leguminosae） M /Flora Of China Beijing: Science Press/St. Louis: Missouri Botanical Garden Press. 2010. 10: 121-130.4 傅家瑞，宋松泉. 顽拗性种子生物学M. 中国科学文化出版社，2004:15 R