肿瘤转移关键酶

1、肿瘤转移关键酶李燕杰，李吉学，彭清忠，汤国营，林美丽，郭瑞锋，朱厚础【关键词】,肝素裂合酶lningffulllengthheparanasegeneandexpressinffuntinalheparanaseinaalianells【Keyrds】heparinlyase;geneexpressin;S7ells;Hells【摘要】目的：分散出乙酰肝素酶(heparanase,HPA)全长编码基因并在哺乳动物细胞中表达出有活性的HPA；探究此酶在哺乳动物细胞中的表达特性；并创立不变表达该酶的细胞株.要领：通过PR法从人胎盘DNA文库中扩增HPA卵白全长编码基因；构建真核表达载体，转化S7细

2、胞举行瞬时表达；阐发HPA卵白的活性和表达特性；转化入H细胞以挑选恒定表达该酶的细胞株.效果：分散扩增出1629bp的人HPA全长DNA序列并构建了其真核表达载体；在转染后的S7细胞和挑选出的H细胞裂解液中检测到较高的HPA活性和相对分子质量(r)巨细约53103的目的卵白免疫印迹表达带.结论：本研究分散出人HPA编码基因全序列；在真核细胞内乐成表达出有活性的人HPA，创造此酶在S7和H细胞中表达在细胞内，很少排泄到细胞外；挑选出其恒定表达细胞株，为进一步研究HPA布局成效、开拓其抗体及按捺剂提供了有力的东西.【关键词】肝素裂合酶；基因表达；S7细胞；H细胞0弁言乙酰肝素酶heparanase

3、,HPA是一种内源性葡萄糖醛酸酯酶，识别硫酸乙酰肝素卵白多糖heparansulfateprteglyan，HSPG的多糖侧链硫酸肝素链heparansulfate,HS的特异布局，并将其落解为1020个糖单元巨细的短糖链1，该酶粉碎细胞外基质和基底膜，低落细胞间质屏蔽成效，促进肿瘤细胞侵入基质和血管壁2，在肿瘤转移历程中起紧张作用3,4.HPA是迄今创造的唯一的作用于细胞外基质多聚糖身分的酶，为我们提供了一个抗肿瘤转移的新药物靶点.得到编码HPA卵白的全基因，构建、挑选有用的卵白表达载体和细胞株，是进一步研究人HPA成效特性，以及研发抗HPA药物等的紧张底子和条件.我们拟分散出HPA编码基因

4、的全序列，在真核细胞中表达完备并具有活性的HPA卵白，探究此酶在哺乳动物细胞中的表达特性，并挑选恒定表达完备HPA卵白的H细胞株，为进一步的研究提供底子.1质料和要领1.1质料大肠杆菌TP10感觉态细胞购自Invitrgen公司；S7，H细胞株由军事医学科学院生物工程研究所保存；pGET载体由军事医学科学院生物工程研究所保存；真核表达载体pDNA4/yHis购自Invitrgen公司；人胎盘DNA文库购自lnteh公司.总RNA提取试剂盒SVTtalRNAIslatinSyste，反转录试剂盒IPrIITReverseTransriptinSyste，质粒提取试剂盒均购自Prega公司；凝胶接

5、纳纯化试剂盒购自Qiagen公司；HeparanDeagradingEnzyeAssayKit购自日本TAKARA公司.限定性内切酶Pst，Xh，T4DNA毗连酶，PR扩增所用试剂为TAKARA公司产物；造就基RPI1640，胎牛血清，Zein，脂质体LIPFETAINE2000购自Invitrgen公司；useAntiyAntibdy和AntiuseIgGHRP购自Invitrgen公司.2效果2.1人乙酰肝素酶基因的分散扩增与断定PR扩增产物在8g/L琼脂糖凝胶电泳胶上呈单一特异性条带Fig1.经序列测定和比力，此基由于人HPA全长编码基因.2.3S7细胞中乙酰肝素酶卵白的检测转染后48h

6、网络细胞，对细胞裂解液和造就基举行esternblt检测，创造细胞裂解液中可见一免疫印迹条带，r约为53103，在造就基中未检测到免疫印迹条带Fig3.2.4Zein的最低敏感度在zein的造就基中，按捺细胞生长一半的浓度为25g/L，定为最低敏感浓度，挑选浓度为敏感浓度的2倍：50g/L.细胞的生长曲线见Fig4.2.5H细胞中HPARNA和卵白的检测挑选出的4个阳性细胞集落扩大造就后，网络细胞，提取细胞总RNA，反转录合成DNA.以DNA作为模板，以相应引物举行PR扩增，PR扩增产物在8g/L琼脂糖凝胶上呈单一特异性电泳条带，巨细为1.6kb，与预期同等(Fig5).在4株阳性细胞中均可检

7、测到特异的卵白免疫印迹条带(Fig6).3讨论别的，本研究还创造，在细胞裂解液中检测到了大量的HPA卵白，表白HPA卵白在细胞中大部门定位于细胞内.为探究此酶是否被排泄到细胞外，我们对细胞造就液中的卵白举行免疫印迹检测，没有创造条带.随后，我们又对百般本HPA的活性举行了检测，创造在细胞造就液中检测到的HPA活性远远弱于细胞内，活性检测效果与免疫印迹效果一样等.提示HPA大部门定位于S7和H细胞内，没有或很少被排泄到细胞外.此效果与ritGldshidt的研究符合7.提示HPA在生理条件下位于细胞内，其表达和排泄受到严酷的调控，以免其过分表达排泄对细胞外HSPG错误切割而造成构造损伤，产生种种

8、病变.而在肿瘤细胞中，不但其表达程度增长并且其调控机制产生紊乱，HPA被大量排泄到细胞外基质中从而促进肿瘤细胞转移，此机制需进一步深化研究.【参考文献】1PikasDS,LiJP,VldavskyI,etal.SubstratespeifiityfheparanasesfrhuanhepataandplateletsJ.Bilhe,1998;273(30):18770-18777.2VldavskyI,FriedannY,Elkin,etal.aalianheparanase:Genelning,expressinandfuntininturprgressinandetastasisJ.Nat

9、ed,1999;5(7):793-802.3Elkin,IlanN,IshaiihaeliR,etal.Heparanaseasediatrfangigenesis:defatinJ.FASEBJ,2001,15(9):1661-1663.4VldavskyI,FriedannY.leularprpertiesandinvlveentfheparanaseinaneretastasisandangigenesisJ.JlinInvest,2001;108(8):341-347.5BehzadF,BrenhleyPE.AultiellfratassayfrheparanaseJ.AnalBihe,2022;320(2):207-213.6FairbanksB,ildnerA,LeneJ,etal.Pressingfthehuanheparanasepreursrandevidenethattheativeenzyeisa