常规PCR实验演示文稿

1、常规PCR实验演示文稿第一页，共三十三页。掌握： 1、PCR的基本操作方法。 2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA的基本原理和方法。理解： 1、PCR仪的使用方法。了解： 1、PCR体外扩增的原理及其引物设计原则。 2、扩增过程中各因素对扩增结果的影响。教学目的：第二页，共三十三页。1、PCR反应体系的建立。2、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。教学重点：教学难点： 1、PCR反应程序的设计方法。第三页，共三十三页。一、基本原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）：体外DNA酶促扩增技术，能特异高效地在体外扩增目的DNA片段。第四页，共三十三页。PCR反应的基本步骤

2、变性94C双链DNA模板被加热变性成两条单链退火4560 C（Tm-5C）寡聚核苷酸引物按碱基互补配对原则与单链模板DNA特异结合延伸72CDNA聚合酶作用下，以引物为起始，合成与模板DNA互补的新链第五页，共三十三页。Cycle 255 555Primer 15Primer 2Cycle 1 5 5Template DNAPCR技术的工作原理55 555 5 55第六页，共三十三页。Cycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。第七页，共三十三页。琼脂糖凝胶电泳原理把DNA样品加入到琼脂糖凝胶的样品孔中，并置于静电场上

3、。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。在电泳前向凝胶或样品中预加示踪染料，电泳过程中染料同DNA结合，电泳后在紫外光照射下，可观察到荧光，从而对分离的DNA进行检测。第八页，共三十三页。二、操作步骤第九页，共三十三页。模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶(如Taq酶)dNTPs反应缓冲液（含Mg2+） PCR反应的基本组分第十页，共三十三页。10PCR缓冲液（Mg2+Plus） 5ldNTP混合物（2.5 mM） 4l上游引物（10M） 2l下游引物（10M） 2

4、lDNA模板 4lTaq DNA聚合酶（2.5 U/l） 1l去离子水 32l实验步骤一：PCR反应体系的建立（重点）50 l2345671加样顺序第十一页，共三十三页。PCR反应程序的设计（难点） 预变性： 94 5 min 变性： 94 30 sec 退火： 55 30 sec 延伸： 72 40 sec(60 sec) 最终延伸： 72 5 min 保存： 4 for ever25cycles实验步骤二：PCR反应程序的设计第十二页，共三十三页。PCR程序设计的主要因素循环温度和时间Tm的概念： 在双链DNA解链过程中，紫外吸光度的变化A260达到最大变化值的一般时所对应的温度。Tm计算

5、方法碱基数小于20： Tm=4(GC%)+2(AT%)碱基数大于20： Tm=81.5+0.41(GC%) (675/引物长度)第十三页，共三十三页。主要实验仪器PCR仪第十四页，共三十三页。主要实验仪器PCR仪第十五页，共三十三页。实验步骤三：结果检测琼脂糖电泳检测PCR产物1. 试剂：50TAE电泳缓冲液：Tris 242 g，乙酸57.1 ml， 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）100 ml，定容至1 L，高压灭菌后备用。1TAE电泳缓冲液：20 ml 50TAE电泳缓冲液加入双蒸水，定容至1 L。2. 1琼脂糖凝胶的配制： 100 ml TAE电泳缓冲液中加入1 g琼脂糖，

6、摇匀后放入微波炉中，小火加热几分钟至溶液透明位置，取出后冷却至56左右时，加入微量（3.5 L）的EB（溴化乙锭），混匀后倒入槽中，冷却后待用。第十六页，共三十三页。不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围 琼脂糖/标准高强度低熔点0.30.5700bp25kb0.8500bp15kb800bp10kb800bp10kb1.0250bp12kb400bp8kb400bp8kb1.2150bp6kb300bp7kb300bp7kb1.580bp4kb200bp4kb200bp4kb第十七页，共三十三页。3. 上样反应结束后取5L反应产物，加入1L上样缓冲液（6loading buffer），用1%

7、琼脂糖凝胶电泳检测。 指示剂：溴酚蓝Marker：DL2000。注意： 加样孔位于负极，DNA由负极向正极泳动4060第十八页，共三十三页。4. 电泳 电泳100 V，10 min左右。5. 观察 凝胶成像系统或紫外灯下观察结果 （手套拿取凝胶）第十九页，共三十三页。三、注意事项 1、注意移液枪的正确使用方法。 2、按顺序逐一加入PCR反应体系各组分，切勿遗漏。 3、取用各组分时，应避免污染和贴枪头壁损失。 4、按操作步骤正确设置使用PCR仪。 5、带手套操作实验。第二十页，共三十三页。四、影响PCR反应的因素1、模板 任何来源的各种构型的含量极低的DNA样品都可作PCR的模板。 轻微的污染都

8、会影响PCR的最终结果。2、脱氧核苷三磷酸（dNTPs） 4种dNTP在反应中浓度应相等，过高会抑制Taq酶活性，增加错配的几率。 第二十一页，共三十三页。3、引物(引物的好坏是整个PCR反应的关键) 引物浓度一般为0.10.5mmol/L，浓度太高，会增加非特异性扩增，形成引物二聚体；浓度太低，影响扩增效率和产率。*引物设计的原则长度15 30bpGC含量45 55%两条引物退火温度一致或接近，Tm差值小于5无连续核苷酸引物内部及引物间无互补，以免形成发夹结构和引物二聚体第二十二页，共三十三页。特异性的引物：特异性的产物第二十三页，共三十三页。4、Mg2+浓度Mg2+是DNA聚合酶发挥作用的

9、必须成分；最适浓度一般为0.5-2.5mmol/L,浓度过低则无法启动反应，过高则影响产物特异性。 第二十四页，共三十三页。5、Taq DNA聚合酶 具有53DNA聚合活性外，还具有53DNA外切活性。因此，在某些时候可选择具有校读活性的聚合酶例如Pfu；可以根据需要选择扩增长片段的Taq酶，高速扩增的Taq酶等 反应终浓度以22.5 U/100l为最佳 第二十五页，共三十三页。五、问题分析第二十六页，共三十三页。问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无M样品A样品B正对照第二十七页，共三十三页。纯度：含有抑制物浓度：含量低质量：全长结构：二级结构 原因对策纯化模板或者使用优质试剂盒提

10、取模板DNA加大模板的用量用好的反转录酶用温度高的反转录酶(1)无扩增产物之模板原因第二十八页，共三十三页。引物错误引物设计不好引物降解引物合成、纯化不好 原因对策合成前检查评价、重新设计引物换一管新引物免费重新合成(2)无扩增产物之引物原因第二十九页，共三十三页。退火温度延伸时间循环次数 原因对策递度PCR聚合酶的延伸速度适当增加循环数(3)无扩增产物之PCR条件原因第三十页，共三十三页。 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带问题2：非特异性扩增 M 1 2第三十一页，共三十三页。引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多 原因对策重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓