Q-PCR常见问题及解决方法

1、QPCRQPCR一般来讲，进行e一般来讲，进行eRx都是的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于eR灵敏度高，所以每个样本至少3CtS100-400mM；模RNA10ng-500cNA1ul或者1ul 1ul 10 倍稀释液，要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在操作进程中，还需要根据所用验值，在操作进程中，还需要根据所用x，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反映体系。在反映体 系配置进程中，有下面几点需要注意：化，达到一个最佳反映体系。在反映体 系配置进程中，有下面几点需要注意：.x不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。2.2.Mix进行，减少加样误差。最

2、好能在冰上操作。3.3.每管或每孔都要换新枪头！不要连续用同一个枪头加样！4.4.一切成分加完后，离心去除气泡。5.5.3个平行孔。参比或者校正染（参比或者校正染（ee常用的是ROXT（现ABI 的注册商标了PCR 产物的荧PCR 震荡，校正ROXTMROXTM配制在x或者 e里。如果反映曲线良好或已经ROXTM 染料校正。通常来讲通常来讲eR的反映程序不需要像常规的R那样要变性、退火、延伸3性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp之间，所以只需要变性和退火就可以了。SYBRGreenPCR扩增程序结束后，加一个溶解程序，来形成溶解曲线，判断PCR 产物的特 异性扩增。而溶解程序，

3、号的收集。3.3.仪器设置一切仪器的操作都基本一致。设置的时候囊括反映板设置（一切仪器的操作都基本一致。设置的时候囊括反映板设置（ep）和程序设置m）。我们以 Ie为例，详细看一下反应设置：应设置：A.A.“定量”实验。.实验方法的选择：我们选用的比较t的Rn方法， cNA 为模板进行。C.C.目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。.样本的设置：囊括哪个是实验组，哪个是关于照组。以及负关于照的设置和生物反复的设置。生物反复的设置。E.E.关于照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备.反映程序的设置.反映程序的设置R反映程序的设置要根据不同公司的x。比如BioTeke的952分钟

4、就可以激活NA聚合（ABI的需要10分钟951540个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序。G.G.反映体系的设置：A-G A-G ABIABIROXROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在x里面；也有的是单独分开。要根据不 同公司的x进行这一个步骤的选择。e的x里没有参比染料，所以选择“none”。PCR RUN！五、五、Real-timeR数据分析.Real-timeR常见参数基线（基线（e）3-15 个循环的荧光信号3-15 个循环的荧光信号同一次反映中针关于不同的基因需单独设置基线阈值（threshol）

5、3-153-1510倍手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号鲜明增强。要用同一个阈值。Ct 值:与起始浓度的关于数成线性关系。Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。RR（）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。的荧光发射强度的比值。 Rn： RnRn扣除基线后得到的标准化结果（ Rn=Rn-基线）。2.Ct 2.Ct 值的关键因素模板浓度模板浓度是决定CtCt在15-35之间。之间。反映液成分的影响任何分子的荧光发射都受环境因素影响反映液成分的影响任何分子的荧光发射都受环境因素影响pH 值和盐浓度。PCR PCR 反映的效率PCRCtPCRCt

6、PCR扩增效率低的条件下进行连续梯PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR 效率取决于实验、反映混合液性能和样本质量。一般说来，反映效90-110%之间都是可以接受的。3.3.PCR反映的效果PCRPCRPCRPCR3次平行重5 个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。常见问题1.Ct值出现检测荧光信号的步骤有检测荧光信号的步骤有误:一般G法采用2延伸时采集n法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解引物或探针降解:可经过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足模板量不足:关于未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高

7、浓度做起。模板降解模板降解:避免样本制备中杂质的引入及反复冻融的情况。2. Ct 2. Ct 值出现过晚（Ct38）扩增效率低扩增效率低:反映条件不够优化设计更好的引物或探针改用三步法进行反映；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。反映；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR PCR 各种反映成分的降解或加样量的不足。PCRPCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。3.3.标准曲线线性关系不佳加样存在误差加样存在误差:使得标准品不呈梯度。标准品出现降解标准品出现降解:应避免标准品反复冻融，或重新制备并且稀释标准品。引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针。模板中存在克制物，或模板浓

8、渡过高4.负关于照有信号引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针。模板中存在克制物，或模板浓渡过高4.负关于照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并且注意上下游引物的浓度配比。mix 试剂盒。模板有基因组的污染：模板有基因组的污染：RNANA的引入，或经过引物设计避免非特异扩增。引物设计避免非特异扩增。5.溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并且注意上下游引物的浓度配比。5.溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引

9、物的浓度，并且注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓渡过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix试剂盒。模板有基因组的污染：模板有基因组的污染：RNANA的引入，或经过引物设计避免非特异扩增。引物设计避免非特异扩增。6.扩增效率低反映试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反映条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。6.扩增效率低反映试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反映条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。PCR 度稀释，再加入反映体系中，减少克制物的影响。度稀释，再加入反映体系中，减少克制物的影响。7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？判断标准：扩增效率，灵敏

10、度，特异性7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性90%-110%8.8.扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？参比染料设定不正确x参比染料设定不正确x不加参比染料时，选模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解PCR 问题汇总1.PCR1.PCR仪的开关机顺序是怎样的？的频率。PCR 仪主机，等主机PCR 的收集软件，进行实验。关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR 仪主机的电源，最后关闭电脑。方？PCR方？PCRml2lABIPCR耗材的具体使用方法和货号见下表：2.PCR实验使用？有何需要注意的地3.3.为什么要定期关于电

11、脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？PCR 碎片整理的方法如下：碎片整理的方法如下：Winows桌面上，选择开始(start)，我的电脑(Mycomputer)。在(在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并且选择(属性)property。在在(属性)关于话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(efragmentnow)now)。单击碎片整理单击碎片整理(efragment)。当显示当显示“碎片整理完毕”关于话框时，单击（确定）。在在“本地磁盘属性”关于话框中，单击（确定）。为计算机机中剩余的驱动器反复如上步骤。为计算机机中剩余的驱动器反复如上步骤。.何时执行sek更新？则请不要更

12、新控制定量则请不要更新控制定量PCR仪的计算机的操作系统。新版本的MicrosoftWinows操作系统有可能与SS软件存在冲突，并且导致仪器不能正常运行。如果您希望安装如果您希望安装ek（更新包）以更新操作系统，应察看随S软件提供的版本说明，避免兼容性问题。件提供的版本说明，避免兼容性问题。5.应该备份哪些数据？5.应该备份哪些数据？PCR仪的各种纯荧光光谱校正文件、背景文件和安装验证实验C:/Appliebiosystems/SS ocument。下图是校正文件的样本。图是校正文件的样本。6.怎么样的实验室环境才能保证仪器设备正常运行？荐做到以下几个方面：6.怎么样的实验室环境才能保证仪器

13、设备正常运行？荐做到以下几个方面：UPS 或稳压器。通风：仪器的通风应该没有阻挡。10-30C 之间。湿度：20-80%；关于于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。空间：易于操作，安全。7.湿度：20-80%；关于于潮湿的省份，推荐实验室配备除湿机。空间：易于操作，安全。7.pcr仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？高信号，则表明该孔可能被荧光污染物。ROI 的校正，当某个孔的信号鲜明高出其他孔时，则表明该孔被污染。当某个孔的信号鲜明高出其他孔时，则表明该孔被污染。清除样本加热块污染的步骤如下：用移液器吸取少量乙醇并且滴入每个污染的反映孔中。清除样本加热块污染的步骤如下：用移液器吸取少量乙醇

14、并且滴入每个污染的反映孔中。吹打数次。吹打数次。将废液吸入废液杯中。反复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。确认反映孔中的残留液体蒸发完。8.将废液吸入废液杯中。反复以上步骤：乙醇三次，去离子水三次。确认反映孔中的残留液体蒸发完。8.什么是背景校正？多长时间执行一次背景校正？PCR PCR PCR10分钟内连续读取背景校正板的荧光强度，CS实验数 据中扣除背景信号。因为背景荧光的信号强度随着许多外界因素（比如外来的污染、反映板因为背景荧光的信号强度随着许多外界因素（比如外来的污染、反映板/反应管的生产厂商不同、水的纯度等）而变化，所以推荐定期进行背景校正，一般每三个月到半年校正一次。应管的生产厂

15、商不同、水的纯度等）而变化，所以推荐定期进行背景校正，一般每三个月到半年校正一次。9.什么是纯荧光校正？多长时间校正一次？9.什么是纯荧光校正？多长时间校正一次？而确定样 品中的荧光染料种类和信号强度。ROI 校正。10.9610.96孔板怎样封膜？96 96 96 压使之密封。压使之密封。11.11.8 连管做实验时，在样本加热块上应该怎样安排放置？8 连管做实验，并且且样本数量不多的时候，建议在样本加热块(TRAY)上关于称地安放样本，最好是纵向放置，并且且优先放在第6 列或第 7 列，然后 逐渐向两边放置。这样做的好处是热盖压下来的时候不至于发生倾斜，各然后 逐渐向两边放置。这样做的好处

16、是热盖压下来的时候不至于发生倾斜，各个反映管的受力和受热都比较均匀，提高孔与孔之间的数据精密性个反映管的受力和受热都比较均匀，提高孔与孔之间的数据精密性.12.绝关于定量与相关于定量有什么区别？绝关于定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝12.绝关于定量与相关于定量有什么区别？绝关于定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。100%，将经处理的样关于于未处理样本的百分比。量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。CT NA RNA 的稀释比例而不pg 数的样本做一系列梯度稀释。梯度稀释

17、。CTCTCTNA浓度的关于数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相关于百分比，其计算公式是。计算不同样本之间的相关于百分比，其计算公式是。NA 含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。验数据的解释有一定难度。13.验数据的解释有一定难度。13.PCR基因表达的实验数据应该如何处理？总的来说，有三个层次的校正是必需要做的。ROX，这样由于反映总PCR ROX 校正能够极大地改进定量的精确度，提高反复管之间的数据重现性。够极大地改进定量的精确度，提高反复管之间的数据重现性。含量是 必要的。方法是在定量目的基因（

18、含量是 必要的。方法是在定量目的基因（IL-2）的同时定量一个内关于照基因（因（18S RNA 基因），IL-2/18S。内关于照校正使不同样本的实验数据可以相互比较。据可以相互比较。第三，计算相关于于基准样本)第三，计算相关于于基准样本)的相关于基因含量。比如研究处理和未处理的、06小时的、正常和患病的之间的基因表达的差别，则需要计算处理/未处理、6小时/0小时、患病/正常。14.14.标准曲线法相关于定量的数据应该怎么处理？0、0、24、48IL-2基因在某种组18SRNA基因。IL-218SRNARNApg数，数据的处理方法见下表：15.15.CT值比较法？数据怎么处理？CTCTNA浓度

19、的关于数成反比：如果(1)PCR如果(1)PCR反映效率相同；(2)PCR的反映效率接近100%，可以从上面的公式推出相关于含量(X01/X02)=2 -CT。假设实验的0、24、48IL-2基因在某种组织中的表达量的18S RNAIL-2 18S RNACTRNApg数。16.16.每个反映管中可以加入多少种探针？几个方面。几个方面。首先是仪器的硬件构成和软件的解析能力。在软件解析能力足够的前提下，PCR仪如激光管-CC类型关于于探针的数量实际上是没有限制 的。如果信号的采集要经过滤色片，那么探针的数量取决于滤色片的数目，制 的。如果信号的采集要经过滤色片，那么探针的数量取决于滤色片的数目，AB 公司的仪器为 例，7900器为 例，79007700是激光-全波长检测的，7000、73004色滤色片的，75005色滤色片的。45种荧光的水平。PCR ROX校正荧光PCR ROX校正荧光占去一种荧光n探针的淬灭基团)也要占用一种 荧光，关于于4 色检测的仪器来说，只剩下2 种荧光可以标记探针，关于于5 色检测的仪器还有3种荧光可以使用。如果将探针改用nB探针，由于它的淬灭基团是不发荧光的比之n探针就可以多1种荧光用于标记探针ROX校正（AB公司不推荐这样 做