漂浮浒苔的纯化培养

1、毕业设计（论文）（2017届本科）题目：漂浮浒苔的纯化培养学院：海洋科学学院专业：环境海洋学班级：2013级海环1班姓名：徐一鸣学号：1321112指导教师：张建恒2017年4月目录 TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark4 o Current Document 目录I摘要1 HYPERLINK l bookmark13 o Current Document 引言21材料与方法4 HYPERLINK l bookmark16 o Current Document 1.1材料41.1.1浒苔藻种的收集与培育4 HYPERLINK l bookmark19 o Cur

2、rent Document 1.1.2浒苔生殖细胞（孢子或配子）的放散4 HYPERLINK l bookmark22 o Current Document 1.1.3浒苔孢子或配子的纯化4 HYPERLINK l bookmark25 o Current Document 1.1.4浒苔孢子或配子的固着、萌发及其生长51.1.5浒苔幼苗的保种5 HYPERLINK l bookmark28 o Current Document 2结果63讨论104小结11参考文献13漂浮浒苔的纯化培养摘要：本文开展了漂浮浒苔的纯化培养工作，从浒苔抱子的放散、纯化、苗种培育及保种技术等方面做了 一系列研究，结

3、果发现成熟浒苔藻体一般在切段充气培养2d后开始大量放散，藻体经历由深绿色变为黄色 进而转变成白色；利用抱子/配子的正负趋光使其聚集在一处使其浓缩，用拉丝处理后的移液器（仅允许抱 子大小通过）收集抱子/配子，能极大提高其纯度并减少污染，重复3次左右可大大减少污染，达到纯化的 目的；光照使大量配子聚集在一起，呈现簇状萌发，但聚集在一起的细胞因为接触紧密或堆叠而无法受光 或缺乏营养盐而出现大量死亡现象，黑暗处理能使抱子/配子均匀附着在培养皿底部，经暗处理2d后完全 附着并变为圆形，光照培养抱子/配子萌发并经历2细胞期、3细胞期、4细胞期等阶段，附着部位细胞发 育成假根，呈辐射状生长，上部细胞发育成叶

4、状体，纵向分裂生长，当长到20细胞长度以上时假根间一般 会相互缠绕；刮下藻体经2L-3L-5L扩大培养至藻体幼苗直径达1mm左右，用灭菌蒸馏水强力冲洗可大大 减少硅藻污染，再转移到添加营养盐的灭菌海水的离心管（50ml）中密封，置于低温培养箱（光照100lx， 温度10C）下可长期保存，从而实现漂浮浒苔的纯化培养。关键词：浒苔，纯化，培养，生殖细胞，漂浮Purification and culture of EnteromorphaAbstract：In this paper, we carried out a series of studies on the purification and

5、 culture of Enteromorpha prolifera, and the results showed that the mature algae species were generally cultured after 2 days Began to mass dissipation, algae experience from dark green to yellow and then into white; the use of spores / gametes of positive and negative dampness to make it concentrat

6、ed in a concentrated, with a wire after treatment pipettes （only allowed spore size Through the collection of spores / gametes, can greatly improve its purity and reduce pollution, repeat 3 times or so can greatly reduce the pollution, to achieve the purpose of purification; light so that a large nu

7、mber of gametes together, showing clusters of germination, but gathered together cells Because of the close contact or stacking and can not receive light or lack of nutrients and the emergence of a large number of deaths, dark treatment can spore / gametes evenly attached to the bottom of the dish,

8、after dark treatment for 2 d completely attached and become round, light culture spores / Germination and experience 2 cell stage, 3 cell stage, 4 cell stage and so on, the attachment part of the cells developed into a pseudo root, was radial growth, the upper cell Into the foliage, the longitudinal

9、 division of growth, when the length of 20 cells or more when the roots are generally intertwined with each other; scraping algae by 2L-3L-5L expanded to the body diameter of about 1mm, with sterile distilled water Strong flushing can greatly reduce the diatom pollution, and then transferred to the

10、nutrient-added sterile seawater centrifuge tube (50ml) sealed, placed in low temperature incubator (light 100lx, temperature 10 C) can be long-term preservation, in order to achieve Enteromorpha prolifera of moss.Keywords： Enteromorpha prolifera, purification, culture, germ cell, floating引言浒苔(Entero

11、morpha prolifera )是属于绿藻门绿藻纲石莼科浒苔属的一种常 见定生性的大型海藻类，也被人们俗称为青苔，苔条等，是一种会快速繁殖的经 济藻类，其自身无毒，在我国常见的浒苔种类有条浒苔(Enteromorpha clathrata)、 扁浒苔(Enteromorpha compressa)、缘管浒苔(Enteromorpha linza )和肠浒苔 (Enteromorpha intestinalis)等【1。浒苔藻体细长，绿色丝状，中空呈管状、带 状或者叶片状，往往呈丛状，主枝明显，分枝细，长可达数米长。藻体的基部有 固着器可以附生在岩石或与海滩潮间带，有时也会在大型藻类的藻体上

12、附生，通 常生长在潮间带。浒苔历来是各国人民食用的海藻，一般在夏、秋季采收，鲜食有盐腌、盐渍 等，干食有晒干、烘干、烤干等，可放汤、做菜、做饼、加馅等。浙江地区常见 的有苔条饼、千层饼等，这些食品有一种清香可口的风味，深受沿海居民的喜爱。自古以来，浒苔就被认为是可以药用的藻类。很多古代药典都记录了浒苔的 各种功效，它具有软坚散结，清热解毒的功效，主治甲沟炎、颈淋巴肿、手痈、 背痈、疮疖(睥)等。李时珍著的本草纲目就有“烧末吹鼻止衄血，汤漫捣 敷手背肿痛”的记载。浒苔富含蛋白质、粗纤维、矿物质及碳水化合物，同时 含有脂肪和维生素。浒苔还含有较多的维生素B12,是很好的保健食品。浒苔富 含天门冬氨

13、酸，临床将其用于治疗肝炎、肝硬化，是浒苔成为保健品的重要原因 之一。在浒苔的蛋白质当中，氨基酸种类十分齐全，必需氨基酸的含量普遍较高。 浒苔还含有丰富的多糖，同其他海藻类一样，其所含多糖与陆生植物不同，主要 为硫酸多糖。浒苔多糖存在于细胞间，是浒苔的主要活性物质之一。浒苔多糖可 以促进人体淋巴细胞的增殖，表明了它在抗肿瘤方面有用武之地。浒苔多糖使T、 B淋巴细胞增殖反应能力增强，有明显的免疫调节的功能。浒苔多糖可以提高SOD 活力，降低体内MDA含量，从而改善高血脂对机体的损害作用。而且浒苔泛 滥、价格低廉，因此是开发生产药物和保健品的绝佳原料。随着经济不断发展，能源危机和环境污染问题的日趋严

14、重。所以，针对生物质 能源的开发应用研究已经成为重要科研项目。今年来通过研究表明，海洋藻类是 一种优质的生物质能资源。通过各种生物技术,用海洋藻类生产生物柴油、燃料 乙醇、生物氢气和沼气等清洁燃料。而浒苔由于其吸收养分快，繁殖能力强，适宜 人工养殖等原因,成为人们眼中理想的生物质能资源。综合利用浒苔生物质能资 源对于解决资源短缺，推动清洁能源应用具有重要意义。海藻用于水产及畜牧饲料添加剂始于20世纪50年代，现在全世界海藻粉产 量近5万吨，欧洲与北美各国均有不同程度地添加海藻粉用于动物饲料。随着我 国养殖业的迅速发展，饲料紧缺成为了较为突出的问题。而浒苔营养全面，有较 好的的食用和药用价值，因

15、此浒苔制造成海藻粉用于动物饲料既能解决浒苔暴 发、处理难题，又能“变废为宝”提高我国动物饲料资源具有重要意义。随着经济不断发展，能源危机和环境污染问题的日趋严重。所以，针对生物 质能源的开发应用研究已经成为重要科研项目。今年来通过研究表明，海洋藻类 是一种优质的生物质能资源回。通过各种生物技术，用海洋藻类生产生物柴油、 燃料乙醇、生物氢气和沼气等清洁燃料。而浒苔由于其吸收养分快，繁殖能力强， 适宜人工养殖等原因，成为人们眼中理想的生物质能资源。综合利用浒苔生物质 能资源对于解决资源短缺，推动清洁能源应用具有重要意义。近年来，随着我国对海洋藻类的开发，藻类的需求量日益增大，尤其是对绿 藻中的浒苔

16、7-8 需求量成倍增加，海区野生浒苔已经不能满足市场数量和质量的 需求。海区养殖受到水体、潮汐、季节、水污染等不可控影响也制约了我国目前 浒苔产业化的发展，另外由于我国对黄海浒苔爆发所带来的不良影响报道比较 多，使得国内人群对浒苔的观念仍主要停留在“浒苔的生态危害”上9-10，如浒 苔的爆发机制、浒苔的生态特性等11，对浒苔设施化养殖以及加工技术等方面的 研究还不多。事实上随着国际上日本韩国等在90年代加强了对浒苔养殖的技术开发，在养 殖培养基、培养过程环境调控、培养设施等方面已经有了很好的基础12-14。近几 年韩国对浒苔食品的开发已综合利用发展起来了，浒苔养殖加工产业化发展也比 较完善15

17、。我国对浒苔的研究已相当深入，并积累了一定的有关浒苔育苗、养殖及加工 技术的基础，但并未形成产业化，浒苔养殖业及加工业仍处于起步阶段，与国外 技术力量相比仍较为薄弱，与国际上相比有一定的差距16-17要大力发展国内浒 苔养殖加工产业，首要需要研究的是采苗、育苗和保种技术，因此我们需要解决 的问题是如何成功诱导母藻成熟、准确把握孢子/配子放散时机、如何收集和纯 化孢子/配子、如何防止或解决藻体污染以及如何进行有效的保种措施。1材料与方法1.1材料1.1.1浒苔藻种的收集与培育本次试验采用的浒苔（Ulva prolifera）样品采集于2016年5月，浒苔藻体漂 浮生长在南黄海江苏近岸海域（图1-

18、1），用剪刀和镊子从漂浮浒苔基部以上1cm 左右切断，取基部以上部分，用灭菌海水清洗干净，装入盛有灭菌海水的离心管 内，低温运回实验室，用过滤灭菌的干净海水继续清洗，进一步用高温消毒的毛 笔或软刷去除藻体表面杂物和杂藻，并通过形态学和分子鉴定，确定为浒苔纯种。 取健康成熟丝状藻体，培养于光照养箱内，培养条件为温度20C、光照强度100 umolm-zs-1、光周期为12 L:12 D、盐度30，每3天更换1次灭菌的过滤海水， 并充气培养。图1天然浒苔的采集Fig.1 The collection of natural Ulva prolifera1.1.2浒苔生殖细胞（孢子或配子）的放散取生长

19、健康的藻体，在1.1的培养条件下暂养7天，取深绿管状藻体剪成约 3mm片段，无菌淡水冲洗1分钟，按照密度为0.8g/L【18养于烧杯，通气培养23 天，每天取培养液镜检观察是否有孢子/配子放散。对部分未放散完全的藻段采用两种方式进行处理：（1）更换培养液继续充 气培养；（2）不改换培育液连续培育；分别观察两种处理方式藻段孢子/配子的 放散情况。1.1.3浒苔孢子或配子的纯化孢子/配子大量迅速释放后，静置于日光灯下，利用配子/孢子的正负趋光特 性使其聚集在一侧，即孢子/配子浓缩液。将移液器置于酒精喷灯的外焰处灼烧， 待玻璃融化时用镊子夹住该处，离开火源的同时拉丝（图），使用拉丝后的移液 器针孔允

20、许孢子/配子通过，吸取孢子/配子，并置于培养皿，培养皿中添加含有 营养盐的无菌海水，再用单侧光源照射培养皿，待浒苔孢子/配子重新聚集在一 侧时，用新的移液器重新收集孢子/配子，在培养皿中可重复上述步骤对孢子/配 子进行收集和纯化，以孢子/配子在培养皿中第一次聚集并收集为次数1，设置 收集次数分别1、2、3次3个组，每个组设置10个平行，暗处理24h后更换培 养液，于光照培养箱中培养，观察养殖过程中3个组的孢子萌发期的污染情况。1.1.4浒苔孢子或配子的固着、萌发及其生长将收集并纯化后的浒苔孢子/配子于培养皿中，加培养液摇匀，分别置于光 照条件（100“mol2RS-1）和黑暗条件下处理24h，

21、24h后分别镜检观察配子的附 着情况，将黑暗处理后的配子置于光照组相同条件下继续培养，每2天分别观察 一次孢子/配子的萌发和生长情况。1.1.5浒苔幼苗的保种当培养皿中的浒苔幼苗长至1mm左右，用刮板将其刮下并用灭菌海水通气 培养68天，每3d换一次海水，待藻体幼苗长至35mm长时，将藻体放入300 目圆底筛网中，再浸入装有灭菌蒸馏水的容器中，使淡水刚好没过筛网中的藻体 幼苗，利用移液器和胶头相连将淡水和藻体幼苗一同吸出，再用力挤出，利用筛 网的过滤和淡水的冲击力量冲洗藻体幼苗，冲洗810次左右将藻体幼苗移入装 有（含营养盐）的灭菌海水玻璃容器中，用移液器将藻体幼苗和培养液一同吸取 并放入己灭

22、菌的离心管中，封盖，置于10C、200lx光强的培养箱中保存，6个 月后观察离心管中藻体的保存状况并培养藻体幼苗。同时设置一个对照组，对照 组不进行上述冲洗操作，每组设置4个平行。图1-2浒苔幼苗的保种Fig 1-2 the storage ofUlva prolifseedlings2结果实验发现，在浒苔藻体切段培养过程中，先出现藻体变粗变绿，然后藻段从 末端开始变黄，进而孢子放散，藻段发白。镜检发现深绿色藻体细胞已开始形成 生殖细胞囊，在显微镜下细胞囊首先出现质壁分离现象，细胞囊之间的排列间隙 变大，细胞囊内的孢子/配子处于相对静止状态，在发黄的藻段中发现细胞囊内 的生殖细胞开始做剧烈运动

23、，在强光刺激下，大量生殖细胞从生殖细胞囊中快速 放散出来（图），在发白的藻体中发现孢子/配子已完全从生殖细胞囊中放散出 来，只剩下空的藻体细胞壁结构（图）。图1-3浒苔的孢子/配子释放及收集Fig 1-3Ulva prolifepnare release/gametes and collection实验发现，单侧光源照射已释放生殖细胞的藻段可使其聚集在朝向光源的水 体表面一侧，具有正趋光性，显微镜下观察具有两鞭毛，因此释放的生殖细胞为 配子19-20经过不同次数纯化后，配子萌发期第6天3组培养皿中的污染状况（表1-1） 其中纯化1次组污染最严重（图1-4a），并抑制其配子的萌发和生长；纯化3

24、次则未出现污染（图1-4b），生长状况良好，说明释放的配子一般纯化3次即可 达到无污染培养的目的。被污染的地方出现黄色浑浊物，显微镜下观察到污染组 的污染物主要为硅藻污染，其中大部分为舟形藻属；被污染的孢子萌发缓慢甚至 停滞生长。表1-1不同纯化次数的培养皿中的污染状况Table 1-1 Different number of purification of pollution condition in petri dishes纯化次数污染状况（每组10瓶）18瓶污染22瓶污染3未出现污染图1-4培养皿中浒苔孢子的污染状况及未放散完全的藻段生长状况Fig 1-3The pollution co

25、nditionofUlva prolifeprares in a petri dish and not fully radiationalgal growth浒苔藻体切段后，孢子大量释放，除大部分藻段能大量集中放散，还存在一 小部分未放散的藻段。此时，（1）若将未放散的藻段过滤，弃去已放散的液体， 重新加入培养液继续培养，1d后藻段变黄并继续释放孢子。（2）若对未放散的 藻段不进行任何处理继续培养，则未完全放散藻段不会继续释放配子，在35d 后从藻段自体直接长出细密的幼苗（图1-4d），用镊子将长满幼苗的藻段继续分 裂成更小的片段，则生成簇状浒苔幼苗，每个簇状浒苔上有10-100根幼苗不等，

26、这与马家海和丁怀宇的实验结果一致21-25实验发现配子固着期在有光和无光条件下差异很大。（1）光照条件下：由于刚放散的配子活性很高，具有正趋光性，在有光源 条件下会聚集在朝向光源一侧的水体表面，约2小时后，配子活性逐渐降低，游 动能力下降，聚集在水体表面一侧的配子开始下沉，并立即固着在培养皿底部， 镜检发现配子大量聚集在一起（图），鞭毛消失，但彼此间不进行融合，萌发后 呈簇状生长（图）。这与丁怀宇发现浒苔单性生殖的研究结果是一致的22。（2）黑暗条件下：24h后取出培养皿镜检发现配子均匀的附着在培养皿底 部，有先前的梨形变成圆形，鞭毛消失，彼此间没有出现聚集现象（图）。配子 附着后即开始生长，

27、萌发会经历2细胞期、3细胞期、4细胞期等阶段（图1-5df）， 生物学上端细胞纵向分裂形成细长的叶状体，其固着部位形成假根（图1-5gh）， 假根生长过程中会分支并呈辐射状向四周扩大生长，当固着配子密度较大时，其 生长阶段孢子的假根会彼此连接缠绕在一起（图1-5i），用刮板将藻体刮下可进 行藻体幼苗的扩大培养，这为后期浒苔的规模化养殖奠定了基础。图1-5浒苔配子各阶段的生长状况Fig 1-5The growth condition of every stage of the Ulva prolifgonetes6个月后取出离心管，经过冲洗处理的藻体幼苗仍然新鲜如初，有一股清新的海 藻味，且经过

28、几天的培养，能够正常生长；而对照组4个离心管中藻体都已变成 暗黄色，开盖后闻到一股浓烈的腐臭味，镜检发现已被大量硅藻污染，经过培养， 藻体幼苗几乎全部死亡，生长实验失败。3讨论3000深绿色浒苔切段后一般2天后藻体发黄，而藻体发黄到孢子完全放散之间的 时间差非常短，通常在十多分钟的时间内即可完成放散，因此可以将藻体发黄作 为孢子放散的“零界点”，但孢子放散的零界点不好掌控，因此一般实验工作时 选择深绿色的浒苔藻体进行孢子放散实验较为适宜。当浒苔藻段处于放散“零界 点”时停止对其光照处理，藻段即停止放散，而重新给予光照时，藻段又开始大 量放散，因此，浒苔的孢子放散与光照强度是密不可分的。利用放散

29、孢子后的液体继续培养未放散完的浒苔藻段可以使藻段生长成簇 状幼苗，而正常培养液并没有出现这种效果，推测孢子/配子释放后的培养液中 会生成抑制藻体放散的物质，同时也会生成促进藻体生殖细胞萌发的物质。利用 这种方法培养出的簇状浒苔幼苗是生殖细胞直接在原藻体上萌发形成的聚集体， 其形态与集块化获得的幼苗26 类似，但规模较小，产量远远不足，在需求量不大 的情况下也可作为浒苔苗种的一种快速扩增方式。本实验重点研究了一种浒苔孢子的提取和纯化方法，利用孢子的极性特征使 孢子聚集在一处，然后利用拉丝移液管对孢子浓缩液进行吸取和转移，其中拉丝 移液管通过橡胶管和空气过滤装置相连，利用嘴吸取。这种方法的好处在于

30、：拉 丝处理极大的缩小了移液器的孔径范围，一般只允许孢子大小细胞通过，因此可 以排除大量残渣杂质和微生物，提高孢子/配子纯度，用嘴吸取可灵活掌握吸取 孢子的量使其收放自如。在孢子转移到新的培养皿中后，利用孢子的极性使其聚 集在一处，而非孢子物质因为没有极性而不会出现聚集现象，重复几次这样的操 作后可使孢子纯度大大提高，避免了杂质污染，达到提纯的目的。此外，试验中 用到的所有器具必须灭菌处理，避免杂菌污染。本实验观察到当对放散后的浒苔配子进行暗处理后，配子会均匀附着在培养 皿底部，这与光照条件下配子大量聚集的现象差异很大，说明配子在黑暗条件下 做不规则运动，无法利用自身的极性特征进行聚集，因此各

31、配子可以均匀的在水 体中游动，等到活性下降时，就均等的附着在培养皿底部。研究表明，当培养皿游动配子的密度足够大时（习04个/ml） 27，暗处理使 配子固着在培养皿底部后，生长时彼此间的假根会缠绕在一起，因此刮下藻体进 行培养彼此间的假根会相互间进行附着，这种方式可以摆脱了浒苔惯有的固着生 长，呈现簇状生长现象，这也是后期浒苔孢子的集块化技术26的基础。这与配子 在光照条件下形成聚集体并进而呈簇状生长的方式不同，前者配子均匀分布在培 养皿底部，彼此间具有较大的生长空间，成活率可以达到100%；后者是大量配 子聚集并堆积在一起，彼此间生长空间过于拥挤，导致生长缓慢甚至停滞生长， 很多堆积在一起的

32、配子由于受不到光照而大批量腐烂死亡，存活率大大降低，无 法达到大批量培育苗种的目的，因此浒苔生殖细胞放散后应进行黑暗处理才能应 用于大规模的育苗育种。硅藻是浒苔藻体养殖过程中受影响最大的污染源，在培养培养出的藻体难免 会发生硅藻污染辎。硅藻的生长条件与浒苔类似，在较高温度和光强条件下会大 量繁殖，过量的硅藻附着在浒苔藻体表面会阻碍阳光和空气，同时消耗海水营养 盐，严重影响浒苔幼苗的生长。本实验通过利用移液器和胶头相连，将藻体放入 圆底筛网中再浸入装有灭菌淡水的容器中，使淡水没过藻体幼苗，用移液器将淡 水和藻体幼苗一同吸出，再用力挤出，利用筛网的过滤和淡水的冲击力量可有效 冲洗掉藻体幼苗上附着的

33、硅藻，保证藻体的健康清洁，将清洗后的藻体幼苗放入 低温培养箱可长期保存，这些苗种可为浒苔的设施化养殖全年提供源源不断的苗 种源，或用于其他商业用途，在浒苔种质库的建立、藻种保藏及海藻养殖方面都 具有重要作用。小结参考文献张义浩，赵盛龙，吴常文.海洋生物一一藻类M.杭州：浙江大学出版社，2002:33.段德麟，付晓婷，张全斌，张国防.现代海藻资源综合利用M.北京：科学出版社，2016:119.冷扬,刘艳芬.浒苔多糖对机体免疫及糖、脂代谢影响的研究J.农垦医学,2012,(02):171-174.张素萍，颜涌捷，任铮伟，等.生物质油精制的研究进展J.新能源,2000, 22(10):12-17.关

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