超声酶法提取黄柏中小檗碱的工艺研究

1、超声酶法提取黄柏中小檗碱的工艺研究【关键词】黄柏小檗碱纤维素酶超声波ExtratinStudyfBerberinefrrtexPhelldendribyUltrasniave-ellulaseShlfBisieneandTehnlgy，ShenyangAgriulturalUniversity,Shenyang110161,hinaAbstrat：bjetiveTstudytheappliatineffetnextratinfberberinefrrtexphelldendribyultrasniave-ellulase.ethdsBasednthesinglefatrstestandrthg

2、naltesttheeffetfdifferentfatrsnextratinfberberinefrrtexphelldendribyultrasniave-ellulaseasstudied,andextratingnditinsasptiized.ResultsThebestextratinnditinasthattieas2.5h,theperfultrasniaveas80,thevluefellulaseas25l,teperatureas60.nlusinTheberberinefrtexPhelldendriisextratedbyUltrasniave-ellulase,hi

3、hansavetieandenhaneextrat-effiieny,saverganislventandreduetheusefenergy.Keyrds：rtexPhelldendri;Berberine;ellulase;Ultrasniave黄柏是芸香科植物黄皮树或黄檗的枯燥树皮，黄柏具有抗病原微生物、抗溃疡、降压、抗心律失常等药理作用。临床常用于治疗中耳炎、皮肤感染、烧伤、慢性前列腺炎、急性细菌性痢疾、急性胃肠炎等病症1。经实验证明小檗碱是其主要成分之一。本实验主要利用正交设计研究纤维素酶、超声波对黄柏中小檗碱提取量的影响。1材料与仪器1.1材料黄柏购自沈阳东北大药房，纤维素酶由沈阳

4、农业大学生物工程实验室自制。所用试剂均为国产分析纯。1.2仪器722-型光栅分光光度计山东高密彩虹分析仪器,KQ3200DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器)。2方法与结果2.1纤维素酶活力的测定2.1.1酶液配制准确称取500g纤维素酶，溶解后定容至100l容量瓶中，此酶液浓度为5g/l。2.1.2葡萄糖标准溶液的配制准确称取100g分析纯无水葡萄糖，用蒸馏水溶解后，转移至100l容量瓶中，定容至刻度，摇匀。2.1.3葡萄糖标准曲线的制作取8支20l刻度试管标号后按表1参加各试剂。表1葡萄糖标准曲线的制作略将上述溶液混匀后，在沸水浴中煮沸5in，冷却后定容至20l，摇匀。将分光光度计调

5、零，在540n下测其A值。以每个试管中葡萄糖毫克数为横坐标，以对应的A值为纵坐标，绘制标准曲线。2.1.5滤纸酶活力计算滤纸酶活力U/g根据公式：滤纸酶活力U/g=葡萄糖生成量g酶液定容总体积5.56/反响液中酶液参加量l样品重g时间h，1g葡萄糖换算成l：1000g/180g=5.56l,经实验测得，纤维素酶作用后，3个试管的A值为0.013，0.011，0.012。取其平均值为0.012，通过葡萄糖标准曲线查得葡萄糖生成量为0.123g带入公式得：滤纸酶活力=547.104U/g2.2小檗碱的提取及标准曲线的绘制2.2.1粗提将黄柏5g碎成粉状，置烧杯中，参加1/10量的生石灰细粉，加水溶

6、胀30in后，再参加30倍量水浸泡24h后纱布过滤，再用10%的盐酸将滤液pH值调至23，然后参加滤液体积10%的Nal，放置过夜后抽滤，得到盐酸小檗碱的粗提物，此时还含有杂质。将盐酸小檗碱的粗提物用热水溶解并趁热抽滤，滤液冷却静止1h抽滤得到盐酸小檗碱与掌叶防己碱等的混合物，至此黄柏的粗提完毕2。2.2.2盐酸小檗碱标准曲线的绘制精细称取盐酸小檗碱纯品10g，置50l容量瓶中，加95%的乙醇溶解并定容至刻度，作为盐酸小檗碱标准溶液。精细称取此液0.2，0.4，0.8，1.6，2.0l于50l容量瓶中，继续加95%乙醇至刻度并在348n下测定吸光度值，y=0.8055x-0.0097。2.3纤

7、维素酶-超声波对盐酸小檗碱提取率的影响取两组黄柏各5g，粉碎。在一组样品中参加150l石灰水，在另一组中参加130l石灰水和20l浓度为5g/l的酶液。第一组样品浸泡24h后双层纱布过滤，第二组样品在60，功率为60%的超声波清洗器里超声清洗90in后双层纱布过滤，两组滤液用10%的盐酸调pH23，最后参加滤液体积10%的Nal，放置过夜，抽滤，得两组盐酸小檗碱样品。用乙醇溶解并分别定容至50l，在348n下分别测其吸光度值，并在盐酸小檗碱标准曲线上查出各自的盐酸小檗碱。2.4提取条件的单因素考察2.4.1水浴温度对提取效果的影响称取枯燥的黄柏粗粉5g左右，分别于20，40，60，80，100

8、时参加20l酶液，作用1.5h，结果在60时提取量比拟高。2.4.2水浴时间确实定称取枯燥的黄柏粗粉5g左右，于60时参加20l酶液，分别作用0.5，1.0，1.5，2.0，2.5h，结果水浴1.5h时提取量比拟高。表2纤维素酶-超声波对盐酸小檗碱提取率的影响略2.4.3加酶量确实定称取枯燥的黄柏粗粉5g左右，于60时参加酶液10，15，20，25，30l，分别作用1.5h,结果加酶量为25l时提取量比拟高。2.4.4超声功率确实定称取枯燥的黄柏粗粉5g左右，于60时参加酶液20l，超声时间1.5h，超升功率分别为40%，50%，60%，70%，80%，结果超声功率范围为60%时，提取量比拟高

9、。2.5正交实验设计根据黄柏中盐酸小檗碱的提取条件，选定加酶量、温度、时间、超声功率4个因素，以L934正交实验设计系统进展实验。因素程度见表3,正交表见表4。表3因素及程度略表4正交实验略以上分析可以得出结论:各因素对实验指标(含量)的影响按大小次序来说应当是(水浴时间)、D(超声功率)、A(加酶量)、B(水浴温度)，最好的实验方案应当是3A2D3B2,即水浴时间2.5h,超声功率80%,加酶25l,水浴温度60。2.6利用薄层色谱法检测纤维素酶、超声波对盐酸小檗碱成分的影响制备硅胶薄层板一块，取盐酸小檗碱标准样品、未用纤维素酶提取的盐酸小檗碱样品、用纤维素酶提取的盐酸小檗碱样品和用纤维素酶

10、-超声波提取的盐酸小檗碱样品各0.5l，点样。按Hl3eH冰HA=712的比例配制展开剂，将点样后的薄层板放入层析缸中，待展开至规定间隔 时取出晾干。在可见与紫外灯下观察，未用纤维素酶提取的盐酸小檗碱样品、用纤维素酶提取的盐酸小檗碱样品和用纤维素酶-超声波提取的盐酸小檗碱样品薄层色谱图一样。说明，用纤维素酶提取的盐酸小檗碱的成分无变化。3讨论3.1为什么纤维素酶不会影响盐酸小檗碱的成分纤维素酶是一组可以降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。纤维素酶只是破坏黄柏细胞的细胞壁，其细胞内部物质并不含有纤维素类物质，因此纤维素酶对其内容物的成分没有任何影响。所以，提取出来的盐酸小檗碱的成分并不会变化。3.2为什么超声提取会使黄柏中小檗碱的提取量增加且不影响其成分超声提取法是基于超声波的空化作用来加速物质分子运动的频率和速度、增加溶剂穿透才能，以进步药物溶出速度和溶出次数，从而有利于植物有效成分的浸出提取，而它的次级效