分子生物学基因工程4.1pcr原理过程

1、Polymerase Chain Reaction聚合酶链反应DNA体外快速扩增技术PCR技术 PCR的故事末代沙皇尼古拉二世、1918年的流行性感冒病毒、电影侏罗纪公园，以及辛普森杀妻案，这四件事情到底有什么相关？没有。近十几年来生物技术的一项新发明，把它们给连在一块了。这项技术就是“聚合酶链反应”（polymerase chain reaction，PCR）。 神秘的1918年恐怖流感：至少死了2千万!PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明DNA的变性与复性变性复性加热退火1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断

2、重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明PCR技术原理是在试管中模拟DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，这一过程耗时，费力，易出错耐热DNA聚合酶的应用使PCR能高效进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 PCR的发明人，一般公认是穆里斯（K. Mullis），他

3、获得了1993年的诺贝尔化学奖。穆里斯在许多作品中，包括1990年在科学美国人上的一篇文章，及1998年的自传心灵裸舞（Dancing Naked in the Mind Field），都曾提到PCR这个构想的起源。“顿悟” 那是在1983年春天的一个周五晚上，他开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。穆里斯原以为这样简单的想法，应该有人提出过，但搜索文献后却发现没有。PCR技术的发明PCR的发明是DNA操作技术的革命美国Mullis教授 开汽车时的联想 逶迤崎岖的山路 行驶的汽车 1988年发明了PCR技术 1993年获诺贝

4、尔奖PCR技术 PCR技术简史 PCR的基本原理 PCR技术的应用DNA体外快速扩增技术一、PCR的原理与特点 PCR基本原理 在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 变性53533535引物复性35355335P1P2延伸35355335P1P2再变性再复性P1P1P2P2再延伸P1P1P2P2短片段以指数形式扩增长片段以线性形式扩增最终主产物片段长度在P1-P2之间 1、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA 。 2、退火：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。 3、延伸：在DNA聚合酶和4种脱

5、氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）及Mg2+存在条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引

6、物RNA引物PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明DNA解旋解链合成引物子链延长ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53GGAUCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3TAGCGCTATCGCATCG

7、ACGCTGGATCG35AUCGCG5ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA的变性与复性变性复性加热退火PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA的变性与复性变性复性加热退火PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/LPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特

8、点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530

9、轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA94PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9550引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点945072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后2

10、30=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点电泳分析PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点电泳分析PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，24 小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR的应用研究基因克