血管紧张素Ⅱ对高糖诱导NRK52E细胞转分化作用研究

1、血管紧张素对高糖诱导NRK-52E细胞转分化作用研究【摘要】目的讨论血管紧张素(Ang)对高糖诱导大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E转分化的干预作用。方法细胞培养72h后，esternblt检测对照组(0l/L葡萄糖)、高糖组(25l/L葡萄糖)、血管紧张素干预组(10nl/LAng)、高糖血管紧张素干预组(10nl/LAng+25l/L葡萄糖)中转化生长因子1(TGF-1)、型胶原、金属蛋白酶2(P2)、平滑肌肌动蛋白(-SA)以及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)在NRK-52E细胞中的表达。活性氧(RS)含量应用2H2DFDA试剂盒检测。结果高浓度葡萄糖上调TGF-1、型胶原、P2、-S

2、A以及PTHrP表达。Ang明显上调高浓度葡萄糖状态下TGF-1、型胶原、P2、-SA和PTHrP的表达，并进步RS含量。结论Ang可以促进高浓度葡萄糖诱导肾小管导管上皮细胞转分化。【关键词】血管紧张素;葡萄糖;NRK-52E细胞;转分化Abstrat：bjetiveTinvestigatetheeffetithangitensininterventinnhyperglyeia-induedtransdifferentiatinintheepitheliidlnefixedulturefnralratkidney(NRK-52E)ells.ethds72hursafterinterventin

3、,theexpressinftransfringgrthfatr-1(TGF-1),typellagen,atrixetallpeptidase2(P2),-sthusleatin(-SA)andparathyridhrne-relatedprtEin(PTHrP)inNRK-52Eellsasdetetedithesternbltinthentrlgrup(0l/Lgluse),highglusegrup(25l/Lgluse),angitensin(10nl/Langitensin)grupandangitensinplushighgluse(10nl/Langitensin+25l/Lg

4、luse)grup,respetively;andthelevelsfreativexygenspeies(RS)eredetetedbykit2H2DFDA.ResultsTheexpressinfTGF-1,typellagen,P2,-SAandPTHrPereup-regulatedbyhyperglyeia;angitensinarkedlyup-regulatedTGF-1,typellagen,P2,-SAandPTHrPinthehighglusenditinandinreasedRSlevels.nlusinAngitensinuldprtethehyperglyeia-in

5、duedtransdifferentiatininNRK-52Eells.Keyrds：angitensin;gluse;NRK-52E;transdifferentiatin已换醛固酮-血管紧张素-肾素系统(RAS系统)是体内重要的内分泌调节系统，在肾脏部分微炎病症态RAS系统常被激活。肾小管上皮细胞转分化是肾脏纤维化的重要病理根底，有研究发现高浓度葡萄糖通过激活RAS系统，进一步诱导肾小球纤维化1，但对于肾小管导管上皮细胞的研究并不明晰。因此,本实验应用血管紧张素(Ang)干预持续性高葡萄糖状态下大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E，观察各种调控肾小管导管上皮细胞转分化的因子及其标记物，

6、包括转化生长因子1(TGF-1)、型胶原、金属蛋白酶2(P2)、平滑肌肌动蛋白(-SA)以及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)的表达，以讨论Ang对肾小管导管上皮细胞转分化的影响。1材料和方法1.1试剂和仪器DE培养液(美国GIB公司)，胎牛血清(美国Sigaaldrih公司)，Ang(美国Sigaaldrih公司)，一抗试剂(PTHrP、型胶原均购于美国Santaruz公司，TGF-1、P2购于英国ABa公司，-SA购置于美国Dak公司)，HRP标记的Rabbitanti-use二抗(美国Dak公司)，电泳仪(美国BI-RAD公司)，扫描仪(美国GE公司)，酶标仪(美国BiTek公司)。1.2细

7、胞培养大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E购自中科院细胞库，DE培养液参加10l胎牛血清、1l双抗(青、链霉素各1105U/L)、1l/LEDTA。每周传代23次。1.3实验分组与处理空白对照组(ntrl组)：无糖培养基，未进展干预。高糖组(Glu组)：含25l/L葡萄糖DE培养基培养。血管紧张素干预组(Ang组):无糖DE培养基参加10nl/LAng干预。高糖血管紧张素干预组(Glu+Ang组)：DE培养基中参加25l/L葡萄糖、10nl/LAng干预。各组设3复孔。均在37、5%2条件下培养3天，每24h换液1次。1.4esternblt检测蛋白表达进展常规细胞裂解获取蛋白后，与预染蛋白

8、arker一起上样,经别离胶和浓缩胶进展SDS电离，完毕后将蛋白质电转印到PVDF膜上，将膜放入含100g/L脱脂奶粉的TBST中封闭，4过夜，然后与TGF-1、型胶原、P2、-SA以及PTHrP等一抗分别按1100、175、1125、175及150的比例室温孵育90in(-SA及型胶原4过夜)，用TBST液洗膜5in3次，PVDF膜分别与辣根过氧化物酶标记的相应二抗(11000)室温孵育45in后，用TBST液洗膜3次，每次5in。用EL显色试剂盒显示目的条带。esternblt图片检测采用Gel.D-Itiagingsyste扫描分析仪扫描凝胶图谱，采用TtalLab分析软件对条带进展密度

9、扫描分析。1.5活性氧(RS)检测经处理72h的各组细胞参加10l的1l/L2H2DFDA(美国Invitrgen公司，终浓度为10l/L)染色液,37避光孵育30in,离心，PBS洗2次，重悬于1l含10%胎牛血清的DE培养液中。用全自动定量绘图酶标仪检测光密度(D)值,激发波长485n，发射波长528n。1.6统计学处理所有实验均重复3次。应用SPSS11.5统计软件，采用ne-ayANVA-SNK法比拟总体和组间差异，检验水准=0.05。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1Ang对高糖诱导NRK-52E细胞株中各种肾小管导管上皮细胞转分化调控因子表达的影响结果见图1。Glu组、Ang组TG

10、F-1、型胶原、P2、-SA及PTHrP的表达明显高于ntrl组，但2组间无明显差异;Glu+Ang组TGF-1、型胶原、P2、-SA以及PTHrP的表达明显高于Ang组，Glu+Ang组TGF-1、-SA以及PTHrP的表达明显高于Glu组。提示Ang能明显促进高浓度葡萄糖状态下TGF-1、型胶原、P2、-SA以及PTHrP的表达。2.2Ang对高糖诱导NRK-52E细胞株RS含量影响结果见图2。Glu+Ang组RS含量明显高于ntrl组及Glu组，提示Ang能明显促进高浓度葡萄糖状态RS含量程度。3讨论糖尿病肾病最终转归为肾功能衰竭，其发活力制主要是肾脏纤维化。有研究说明高血糖通过微炎病症

11、态诱导肾组织纤维化是其最重要的病理根底，而微炎病症态常常激活RAS系统，进而恶性循环不断促进肾脏组织纤维化1。然而对于肾小管导管上皮细胞转分化为成纤维细胞等的研究却很少见，为此本研究目的为讨论其机制。本研究提示，在高浓度葡萄糖或Ang分别作用72h后，NRK-52E细胞TGF-1、型胶原、P2、-SA以及PTHrP表达程度均明显上调。既往研究提示，高浓度葡萄糖通过诱导肾小管导管上皮转分化，主要通过上调TGF-1、型胶原、P2、-SA以及PTHrP等蛋白程度，从而加重肾小球硬化及肾间质纤维化2-5，而Ang同样可以从多个程度影响炎症通路信号转导，从而加重纤维化的进程6-7。故此说明高血糖及Ang

12、均可能通过上调TGF-1、型胶原、P2、-SA以及PTHrP等多种蛋白程度，参与糖尿病肾小管导管上皮转分化病程。为进一步说明Ang对于高浓度葡萄糖状态下肾小管导管上皮转分化进程的干预作用，本研究应用Ang在不同条件下干预NRK-52E细胞株，结果发现，Ang能明显上调高浓度葡萄糖状态下TGF-1、型胶原、P2、-SA以及PTHrP的表达。Liu等8研究也提示Ang高度表达能通过促进TGF-1等系列因子表达从而加剧糖尿病肾脏功能损害。说明Ang能明显促进TGF-1、型胶原、P2、-SA以及PTHrP等蛋白表达，从而可能促进肾小管导管上皮细胞转分化。在进一步研究中发现Ang同时能明显进步高糖状态下

13、NRK-52E细胞株RS含量，由于氧化应激是诱导肾小管导管上皮转分化重要因子6-7，本组结果也进一步验证了Ang可能加剧高糖状态下肾小管导管上皮细胞转分化的进程。【参考文献】1SanhezAP,SharaK.TransriptinfatrsinthepathgenesisfdiabetinephrpathyJ.ExpertRevled,2022,11:e13.2LS,henH,HsiehTJ,etal.LalatinfendgenusrenaltubularatrialnatriuretipeptideJ.JellPhysil,2022,219(3):776-786.3HillsE,Al-Ra

14、sheedN,Al-RasheedN,etal.-peptidereversesTGF-beta1-induedhangesinrenalprxialtubularells:ipliatinsfrtreatentfdiabetinephrpathyJ.AJPhysilRenalPhysil,2022,296(3):F614-F621.4HlianJ,Qi,KellyDJ,etal.RlefKruppel-likefatr6intransfringgrthfatr-beta1-induedepithelial-esenhyaltransitinfprxialtubuleellsJ.AJPhysi

15、lRenalPhysil,2022,295(5):F1388-F1396.5LiH,LiuD,ZhaQ,etal.Highgluseprtesllagensynthesisbyulturedellsfrratervialpsterirlngitudinalligaentviatransfringgrthfatr-beta1J.EurSpineJ,2022,17(6):873-881.6GrudenG,PerinP,aussiG.InsightnthepathgenesisfdiabetinephrpathyfrthestudyfpdyteandesangialellbilgyJ.urrDiabetesRev,2022,1(1):27-40.7anabeE,Hand