基因工程的基本操作程序(上课)

1、专题1基因工程1.1DNA重组技术的基本工具1.2基因工程的基本操作程序1.3基因工程的应用1.4蛋白质工程的崛起本节知识体系基因工程的基本操作程序：一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定1.2基因工程的基本操作程序专题1基因工程原核细胞的基因结构原核细胞基因编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，不能转录并不能编码蛋白质，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等它山之石原核细胞的基因结构 RNA聚合酶的作用是催化DNA转录为RNA。它能够识别调控序

2、列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。它山之石 RNA聚合酶是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。 真核细胞的基因结构真核细胞基因编码区（间隔、不连续）外显子：能编码蛋白质的DNA序列内含子：不能编码蛋白质的DNA序列非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子它山之石真核细胞的基因结构与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是： 编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列

3、被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。 其中，能够编码蛋白质的序列叫做外显子，一般不能够编码蛋白质的序列叫做内含子。它山之石原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是连续的编码区是间隔的、不连续的相同点都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的它山之石编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？思考？基因的种类（1）编码蛋白质的基因：包括结构基因和调节基因。（2）没有翻译产物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。（3）不能转录的DNA片段：如操纵基因。它山之石启动子与终止子 启动子是在非编码区内紧靠转录起点，调控遗传信息表达

4、的脱氧核苷酸序列，它能引导RNA聚合酶与正确的基因部位结合，使转录从起点开始，沿编码区进行。 终止子是在非编码区内紧靠转录终点，调控遗传信息表达的脱氧核苷酸序列，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。它山之石基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取新 授 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。1. 从基因文库中获取目的基因基因文库 基因组文库部分基因文库（cDNA文库）1. 从基因文库中获取目的基因某生物体内全部DNA 许多DNA片段受体菌群体 限制酶 与表达载体连接 导入基因组文

5、库某种生物某个时期的mRNAcDNA 反转录受体菌群体 与表达载体连接 导入部分基因文库（cDNA文库）基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取cDNA为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary DNA之缩写 某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接 导入cDNA文库基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取1. 从基因文库中获取目的基因比较：部分基因文库和基因组文库原理：前提：过程：PCR扩增仪DNA双链复制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列目的基因DNA受热变性解链为单链；引物与单链互补结合；合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。基因工

6、程的基本操作程序一、目的基因的获取2.利用PCR技术扩增目的基因由穆里斯等人于1988年发明，并于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR全称为多聚酶链式反应（polymerase chain reaction)反应过程：1.变性：加热至9095 目的基因DNA解链;2.复性：冷却至5560，引物结合到互补DNA链;3.延伸：加热至7075，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成 基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取2.利用PCR技术扩增目的基因利用PCR技术扩增目的基因动画演示PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核

7、苷酸模板、能量、酶高温下变性解旋解旋酶催化体外复制(PCR扩增仪内)主要在细胞核内热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）大量的DNA片段形成整个DNA分子解旋酶、普通的DNA聚合酶等基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取3. 人工合成：反转录法等基因比较小已知其核苷酸序列已知其mRNA 的序列已知其翻译产物的氨基酸序列 生物材料DNA目的基因的获取mRNAcDNAPCR反转录cDNA文库DNA一定大小范围的DNA基因组文库人工合成限制酶切自然界中分离人工方法合成自然界分离后再人工合成归纳小 结基因比较小，且已知核苷酸序列基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取 构建基因文库是获取目的基因的方法之一

8、，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取寻根问底深度思考为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的生物体内提取不行吗？基因工程的基本操作程序二、基因表达载体

9、的构建-基因工程的核心使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代同时使目的基因能表达和发挥作用。1.构建基因表达载体的目的2. 基因表达载体的组成a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因e、复制原点它们各有什么作用？基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建-基因工程的核心2. 基因表达载体的组成a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因e、复制原点一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾部，起终止转录的作用为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来（如抗氨苄青

10、霉素基因，绿色荧光基因） 它们各有什么作用？外来的编码特定蛋白质的基因DNA复制起点，即DNA聚合酶结合位点 用一定的_切割 质粒，使其出现两个切 口，露出_。用_切断目 的基因，使其产生_ _。3.基因表达载体的构建的步骤将切下的目的基因片段插入质粒的_ _处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建质粒一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA 连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种 限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。DNA分子基因工程的

11、基本操作程序二、基因表达载体的构建-基因工程的核心寻根问底深度思考作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，需要使用启动子和终止子才能比较有利于基因的表达。通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（2） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（3）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（4） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么

12、部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。基因工程的基本操作程序二、基因表达载体的构建-基因工程的核心寻根问底深度思考将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。基因工程的基本操作程序三、将目的基因导入受体细胞转化目的基因进入 内，并且在受体细胞内维持 和 的过程受体细胞稳

13、定表达方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法（最常用80%）基因枪法花粉管通道法显微注射法Ca2+ 处理法1.将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌感染特点：（2）转化原理：基因工程的基本操作程序三、将目的基因导入受体细胞 易感染双子叶植物和裸子植物(对大多数单子叶植物没有感染能力）。 当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（插入目的基因也可转移）可转移至受体细胞的染色体DNA上。1.将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（3）转化过程：基因工程的基本

14、操作程序三、将目的基因导入受体细胞 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体DNA上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达 根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？原因：根瘤农杆菌具有趋 化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。 酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上

15、Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。寻根问底深度思考 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。将目的基因导入植物细胞的其他方法：单子叶植物中常用的一种基因转化方法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。将目的基因导入植物细胞的其他方法：2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射技术（最常用

16、、最有效）（2）转化过程：基因工程的基本操作程序三、将目的基因导入受体细胞发育成新性状动物显微注射取卵（受精卵）目的基因表达载体提纯受精卵发育、移植3.将目的基因导入微生物细胞（1）原核生物作受体细胞的优点（2）转化过程：基因工程的基本操作程序三、将目的基因导入受体细胞繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。（应用最为广泛-大肠杆菌）受体细胞（大肠杆菌）感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子完成转化过程Ca2+处理细胞细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态1.检测与鉴定的目的2.基本思路基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定-检查基因工程是否做成功 确定目的

17、基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性。检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了mRNA个体生物学水平的鉴定检测目的基因是否翻译成蛋白质方法DNA分子杂交方法分子杂交（RNA/DNA杂交）方法抗原-抗体杂交抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等检测鉴定基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定-检查基因工程是否做成功DNA分子杂交技术检测 被检测的转基因生物的基因组DNA被放射性标记的含目的基因DNA片段的探针如果最后出现“杂交带”，则表明目的基因已插入受体DNA中基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定-检查基因工程是否做成功RNA/DNA分

18、子杂交技术检测与被检测的转基因生物的提取出的mRNA混合被放射性标记的含目的基因DNA片段的探针如果最后出现“杂交带”，则表明目的基因转录出了mRNAWestern杂交：蛋白质分子（抗原抗体）之间的杂交。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。具体做法是：第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）；第三步，从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上；第五步，将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原抗体的结

19、合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合，二抗抗体上带有特殊的标记。如果转基因生物的目的基因表达出了特定蛋白质，则结果为阳性。基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定-检查基因工程是否做成功抗原-抗体杂交技术检测基因工程的基本操作程序四、目的基因的检测与鉴定-检查基因工程是否做成功个体生物学水平的鉴定鉴定个体生物学特性是否达到预期：如植物个体的抗虫性或抗病性如：通过抗虫或抗病的接种实验， 确定植物个体是否具有抗性以及抗性的程度。又如：通过生物个体产品功能活性的比较实验， 确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。基因工程的基本操作流程小结归纳: 基因工程的基本操作程

20、序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法、Ca2+处理法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：个体生物学水平的鉴定1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，需要使用启动子才能比较有利于基因的表达。如通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中，此目的基因无法进行转录

21、；（2） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（3） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（4） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因，如绿色荧光蛋白基因等 深度思考2.若想将一个抗病基因导入单子叶植物（如小麦），从理论上说，你认为应该怎样做？深度思考 如果想将一个抗病基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导性）的基因

22、，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？ 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。深度思考基本操作如下：（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中

23、，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。深度思考4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？1. 有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D练习练习2基因工程的操作步骤（ ）使目的基因与运载体相结合将目的基因导入受体细胞检测目的基因的表达是否符合特定性状要求提取目的基因，正确的操作顺序是ABCD3多聚酶链反应可表示为 （ ）A、PECB、PERC、PDR D、PCR练习P