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文档简介

1、血清-球蛋白的分离、纯化与鉴定 （见P157）背景：关键问题： 血清蛋白根据电泳法可分为5类：清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白。1.采用何种方法分离？2.此种方法分离会引入何种杂质？ 如何纯化？盐析凝胶层析3.如何鉴定纯度和含量？电泳和双缩脲法定量一、原理及操作 利用高浓度的中性盐，如(NH4)2SO4、 Na2SO4、 Na2SO3和NaCl等破坏水化膜，中和表面电荷。盐析法一般蛋白质不变性，常用于蛋白质的分离纯化。1. 盐析50%饱和(NH4)2SO4清蛋白溶解球蛋白沉淀33%饱和(NH4)2SO4其余球蛋白溶解-球蛋白沉淀饱和(NH4)2SO4 1ml边加边摇！弃上清加PBS溶

2、解沉淀至1ml静置5min3500r/min 5min1）饱和(NH4)2SO4 0.5ml边加边摇！弃上清加PBS 0.5ml溶解沉淀静置5min3500r/min 5min2）取1ml血清作1ml标记线2. 脱盐1） 装柱排气、调整凝胶浓度、装柱2）加样上步样品加样、进样、洗样3）洗脱收集PBS洗脱；收集（1ml/管)；4）检测收集约10管4）检测NH4+检测（纳氏试剂）蛋白质检测（双缩脲试剂）1234567891011121234567891011121滴洗脱液+1滴检测试剂1滴洗脱液+1滴检测试剂5）收集脱盐的蛋白质液进行鉴定 电泳技术是利用带电粒子在电场中向与其所带电荷相反的电极移动

3、的现象，对混合物组分进行分离、纯化、鉴定和定量的技术。 电泳技术 （见P34）V = EQ6r电泳缓冲液：pH=8.6血清蛋白清蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白pI4.645.065.065.126.857.5分子量（104）695203091530含量（%）607023.5479111218表10-1 血清蛋白含量参考（ P89 )血清蛋白泳动方向？各种血清蛋白泳动顺序？1）电泳前准备2）点样（ 各组点-球蛋白液、每个电泳槽点2份血清）无光泽面点样、量少、一次、迅速电泳操作5）染色丽春红染色液中浸泡 2min6）漂洗依次进行三次漂洗，至背景无色蛋白双缩脲法定量 （见P159）肽键 Cu2+ OH-紫红色复合物蛋白质浓度与A540呈正比二、结果1. 脱盐检测结果1）纳氏试剂、双缩脲试剂颜色反应结果（半定量）2）收集哪些洗脱液用于鉴定2. 电泳鉴定结果绘出血清和-球蛋白液电泳结果3. 双缩脲法定量鉴定结果计算-球蛋白液浓度三、讨论根据结果评价分离效果，分析原因三、结果血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳点样线_+清蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋

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