第四、五章 噬菌体载体及粘粒及目的基因的准备、重组及重组子的鉴定课件

1、第四章 噬菌体载体及粘粒一、噬菌体的一般生物学特性(Bacteriophage)-phagos结构（头部、尾鞘、尾盘、尾针、尾环、尾纤丝）无尾的二十面体、具尾的二十面体、线状体早、中、晚期基因表达基因组结构二、噬菌体载体的构建插入型载体 替代型载体CI基因 SupE（抑制琥珀突变基因）-UAG 麦康凯区别:插入位点、容量噬菌体的包装限制：75%105%J基因到N基因非必要区段占DNA总长度的1/3三、噬菌体的体外包装*重组体DNA分子的转染(transfection)作用105106噬菌斑/gDNA*体外包装转导(transduction)体外包装过程尾部突变-头头部突变-尾E-72%E-累积

2、尾部蛋白D-与DNA进入头部及头部成熟有关D-累积头部蛋白四、凯伦噬菌体载体(charon)两类特点：酶切位点多、含LacZ、容量大克隆程序:分离线性噬菌体DNA-酶切分离左右臂+中央区段-与外源DNA混合-包装几kb23kb噬菌体载体及派生载体的优点：感染效率高2、柯斯质粒载体的特点*具有噬菌体的特性（环化）*具有质粒载体的特性*高容量3、柯斯克隆优点：容量大、非重组体少问题：分子内重组成多聚体（碱性磷酸酶处理） 基因间连接（电泳分级分离）七、噬菌体展示载体(phage display)丝状噬菌体（M13/fd)表面-35拷贝geneIII产物-颗粒组装及F性须吸附G.P.Smith-198

3、5建立-在噬菌体表面表达蛋白应用：噬菌体表面展示文库 *原理 *分离hGH变体八、噬菌粒载体(phasmid)M13类的缺陷：-插入后遗传稳定性下降，且与片段大小有关-实际上总以正向插入-容量有限（1500bp）改进的M13类-噬菌粒-分子小：3kb-容量10kb-双向性（细菌质粒和phage）T3+T71、噬菌体载体的类型及其比较。2、噬菌体的体外包装原理。3、什么是凯伦噬菌体载体？有怎样的特点？4、什么是柯斯质粒载体？有怎样的特点？5、单链DNA噬菌体载体的优点。6、噬菌体展示载体的工作原理。7、噬菌粒载体的特点。复习提纲 Clerke&Carbon公式：N=ln(1-p)/ln(1-f/

4、g)特异mRNA拷贝数/总mRNA种类可克隆片段大小/基因组总长度mRNA丰度克隆基因的大小(载体容量)10670/29%=87000N=ln(1-99%)/ln(1-1/87000)=1.7x1053、RNA的制备及纯化总RNA的提取mRNA的纯化-oligodT-纤维素柱层析特异mRNA的富集（mRNA分级分离、 蔗糖密度梯度离心）特异mRNA的分析鉴定*mRNA体外翻译（麦胚、兔网织红细胞）*RNA电泳-Northern BlotRNaseH方法Self-priming同聚物加尾重组-linker二、cDNA基因文库的筛选与特异重组体的鉴定1、遗传检测*利用载体提供的表型特征*插入基因功

5、能表达2、物理检测*凝胶电泳3、核酸探针（screening a library)4、免疫化学检测*标记抗体探针*免疫沉淀5、转译筛选法*杂交抑制的转译-丰富mRNA*杂交选择的转译-低丰度mRNA-insulin6、正负筛选法组织特异性、发育阶段特异性、特殊处理后基因表达差异三、基因组DNA文库的构建与筛选1、基因组DNA文库：汇集生物体所有DNA序列的重组DNA群体2、目的研究结构基因及其调控序列基因组结构3、目的基因的准备*限制酶切法-鸟枪法(shot-gun approach) 霰弹法*DNA超声随机切断*限制酶部分酶切-比较4、重组DNA分子的构建噬菌体载体构建柯斯质粒载体构建5、重组体的筛选四、PCR方法与化学合成在重组子筛选时，在Ap平板上常出现较大的菌落及周围的小菌落，解释这一现象的原因，如何减少这一现象氨苄青霉素抗性的转化可将内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素，铺平板时密度太高或培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而改用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从60g/ml增至100g/ml，可使情况有所改善，但不能彻底根除之。1、什么是cDNA文库和基因组DNA文库？各有怎样的优缺点？2、如何计算构建文库时的规模？其影响因素有哪些？3、cDNA文库构建过程及其关键步骤的处理和分析。4、cDN