P53与肝癌的基因治疗课件

1、53与肝癌的基因治疗2011级研究生四班：许腾、庄步强、高庆强、 刘稳顺、江海波 2022/9/181肝癌机制抑癌基因p53p53基因与肝癌的基因治疗存在的问题展望2022/9/182 肝癌概念：指肝细胞 或 肝内胆管细胞 较常见的恶性肿瘤，发病率仅次于胃癌和食管癌 本病以4049岁为多，男女发病率之比为251 每年新增病例：50多万 主要临床表现：肝区疼痛、肝脏肿大、黄疸、肝硬化症状等 治疗：手术、介入、放疗、化疗、生物和免疫治疗等 5年病死率：超过95%发生的癌肿2022/9/183 机制 肿瘤发生发展过程中，由于各种基因表达及其调控的变化，使细胞在信号转导网络上表现出与正常细胞的显著差异

2、。正常细胞的一些信号转导通路在肿瘤细胞中表现为过度活跃，而另一些信号转导通路则被阻断。这种细胞内信号转导的异常干扰了细胞对增殖、分化、凋亡等多方面的自身调控，特别是造成细胞增殖和凋亡失控，成为肿瘤发病的重要分子基础。 随着分子生物学和免疫学技术的飞速发展，基因治疗技术在肿瘤的治疗中具有广阔的前景。基因治疗的方式有两类，一类为基因矫正与置换，即将缺陷基因的异常序列进行校正，对缺陷基因进行精确的原位修复；另一类为基因增补，不去除异常基因，而是通过外源基因的非定点整合，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能，达到治疗目的的一种方法。2022/9/184 抑癌基因 抑癌基因的突变、缺失及失活在肝癌的

3、发生发展中起着关键性的作用。目前，新发现的抑癌基因层出不穷，较常见的有p53、p16、Rb、BCL-XS等。随着人们对肝癌发病机制的深人了解，越来越多的证据表明：p53基因的突变与失活和肝癌的发生发展有着密切联系 。近年来，随着手术、放疗及生物治疗等方法的研究进展，使肿瘤综合治疗水平有了明显提高，尤其是肿瘤体外细胞和动物模型基因治疗，逐渐从单纯的基础研究过渡到临床研究和应用。本文主要从p53在肝癌基因治疗方面作一简要介绍。 2022/9/185 DNA damagep53Cell growth arrestApoptosisp53 activation and accumulation2022

4、/9/187 细胞内p53蛋白的浓度增加是其对DNA损伤的应答。这种作用不依赖于基因转录而涉及转录后的调控机制，与预先存在p53mRNA增加的翻译有关。在整个基因表达调控中，转录后的机制是重要的，而且特别是可能比转录调控有更快的应答。该过程涉及胞浆内mRNA-蛋白质的相互作用，但是p53浓度增加的精确机制是不清楚的。2022/9/188病毒法常用的病毒以逆转录病毒和腺病毒作载体，其中逆转录病毒载体只感染处于分裂期的细胞，如肿瘤细胞，而对高分化不分裂的细胞就不能实施基因转移。腺病毒载体则对各期的细胞均可感染，所以目前腺病毒载体更常用作p53转移的载体，腺病毒介导的p53基因治疗已广泛开展。202

5、2/9/1810 Rei-set M等通过实验证实：腺病毒介导的基因转移可有效地将p53基因导人肿瘤细胞中；以GFP为报告基因，观察到了腺病毒对肝癌细胞BEL402 、HLE及HuH 7均有很高的转染率，腺病毒能有效地将目的基因导入肝癌细胞 中并高效表达。BIY2102腺病毒载体转染后能显著提高 p53突变的HIE和HUH27细胞对顺铂和丝列霉素2C的敏感性，增强了化疗药物对HIE和HUH27细胞的杀伤作用，这为以腺病毒为载体将目的基因导人肝癌细胞提供了前提。有资料显示：用野生型p53腺病毒载体经肝动脉注射治疗转移性肝癌的临床试验 ，野生型p53基因导人肝癌细胞中，可以发挥杀灭或抑制肝癌细胞生

6、长的作用 ，Terence 等以受体介导基因转移系统介导野生型 p53转染含突变 p53的肝癌细胞株，发现能明显抑制瘤细胞的生长，通过表达wtp53重组腺病毒载体，将p53基因导人肝癌细胞株一 PLE/PRE/ 5细胞，通过诱导其凋亡和细胞周期阻滞可抑制癌细胞的生长。2022/9/1811举例方法：构建含人p53、B7-1、GM-CSF和IL-2 4种目的基因的重组腺病毒载体，感染3种肝细胞癌细胞系和肝细胞系L02，运用ELISA、免疫组化、流式细胞仪等方法，检测目的基因在肝癌细胞中的表达，和对肝癌细胞生长的抑制及诱导其凋亡的作用。结果：肝癌细胞对腺病毒高度易感，腺病毒多重感剂量为50(50

7、MOI)时，可使90%左右的肝细胞癌表达目的基因。除IL-2外，其他3个目的基因都能在肝癌细胞中高效表达。导入多基因后，肝癌细胞的生长受到一定程度的抑制，并诱导肝癌细胞发生凋亡； 而L02肝细胞的生长却未受影响。结论：腺病毒载体是进行肝癌基因治疗的理想载体，由一个腺病毒载体介导的多种目的基因，能在肝癌细胞系中高效表达，且能抑制肝癌细胞的生长和诱导其调亡。 -腺病毒介导多基因对肝癌细胞生长的影响 中国普外基础与临床杂志 2000年第6期第7卷 2022/9/1812举例方法：将载有人野生型p53-cDNA的真核表达质粒p53-pcDNA3，用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2，用流式细胞

8、仪检测p53-pcDNA3对HepG2细胞生长的影响。结果：通过观察细胞生长曲线与流式细胞仪检测细胞周期和细胞的凋亡指数发现，HepG2细胞生长受到明显的抑制。结论：脂质体介导的p53基因可在HepG2细胞中表达，且明显抑制该细胞的生长。 -脂质体介导的p53基因对肝癌细胞生长的抑制作用 免疫学杂志 2000年第5期第16卷 2022/9/1814PTD 融合蛋白系统 PTD 融合蛋白系统 ( protein transduetion domain ，PTD )是一个富含碱性氨基酸残基的蛋白结构域，PTD融合蛋白系统被认为是一种很有前途的运载工具。丁忠阳等成功构建了含 p53基因的原核表达载体

9、 pTATHAp53 ，在大肠杆菌BI21(DE3)Lyss内诱导表达并进行了纯化。通过纯化的 p53蛋白经腹腔免疫 BALBc小鼠，制备高效价的抗血清，为应用PTD p 5 3基因治疗肝癌的实验研究奠定了理论基础。2022/9/1815 存在的问题 p53基因在治疗人类恶性肿瘤基因治疗中取得了一定的成绩，但仍存在许多不足之处。缺乏高效的载体系统，目前被应用的载体都存在自身局限性，而且病毒本身也可导致相应的不良反应。p53基因目的基因的持续表达。降低p53基因在宿主体内的毒性和免疫原性是否会诱发原 癌基因以及病人的安全性 (如最小治疗剂量、最 大毒性、耐受性及诱变性)等问题都有待进一步解决。2022/9/1817 展望 p53基因是一种理想的分子靶向肝癌治疗基因之一 。通过人工转导修补突变的p53基因，可恢复其抑癌功能，通过拯救突变型p53基因、转染野生型p53基因的方法治疗肝癌不失为一种理想的治疗方法，但还需要更进一步的研究寻找更高转染率的载体、