医学免疫学课件：免疫学检测

1、免疫学检测Immunological detection免疫检测是目前生物学检测方法中用途最广泛的方法之一。具有高度精确、灵敏、特异的特点。可用于免疫学以及相关学科的基础理论和应用研究，也可应用于临床多种疾病的诊断。生物学研究 发病机理研究免疫疾病诊断 : 病原体的抗原抗体检测；自身抗体；疾病的疗效和预后判断。 免疫治疗药物和疫苗的研究 微生物鉴定 动物、植物性状的免疫标记 、生理活动研究（激素、维生素）免疫检测技术在生物医学领域中的应用免疫检测的优点特异性: 抗体能特异性地识别相应的抗原并与之结合, 这种特性是免疫检测方法的基础。可检测: 当抗原和抗体在体外特异性结合后可出现肉眼可见或借助仪

2、器可检测出的反应现象。应用广：试验时既可用已知抗体检测标本中有无相应抗原，也可用已知抗原检测标本中有无相应抗体。体外抗原抗体反应的特点特异性：抗原抗体反应具有高度的特异性。可逆性：抗原抗体反应所形成的复合物并不稳定， 在一定条 件下可解离。（亲和力，pH，离子强度）比例性：抗原抗体的比例合适，才可出现可见的反应现象。 （网格理论）阶段性：特异性结合阶段（快）和可见反应阶段（慢，形成抗原/抗体复合物）。抗原/抗体反应的比例性-网格理论（lattice theory）抗体过剩抗原过剩抗原抗体比例合适沉淀物物形成量抗体量恒定，抗原量递增Equivalence Lattice formation影响抗

3、原抗体反应的因素温度： 在一定温度范围内，提高温度可加速反应速度， 缩短反应时间，常用反应温度为（37-45C度）溶液的pH：pH过高或过低可改变抗原和抗体理化性质， 影响反应结果，因此溶液的pH应适宜（pH 6-8）电解质：反应中必须有适宜的电解质（0.85% NaCl） 参与，否则不出现可见反应。抗原抗体反应类型中和反应凝集反应沉淀反应凝集反应（Agglutination） 颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解质存在的条件下出现肉眼可见凝集块称凝集反应。 直接凝集： 将颗粒性抗原与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。 间接凝集： 将可溶性抗原包被在载体颗粒表面，与

4、相应抗体反应出现颗粒凝集现象。可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液或组织液等）与相应抗体结合，在一定条件下形成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。沉淀反应（Precipitation)液相沉淀反应凝胶扩散沉淀凝胶免疫电泳絮状沉淀环状沉淀免疫浊度沉淀单向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验血清免疫电泳火箭电泳对流免疫电泳免疫印迹絮状沉淀试验将可溶性抗原作一系列倍比稀释，加入一定浓度的适量抗体，产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管为最适比例管。絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，目前多用以测定抗原抗体反应的最适比例。 环状沉淀试验主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。 （诊断

5、炭疽的Ascoli实验、细菌分型、血迹鉴定）。 液相沉淀反应凝胶扩散沉淀指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩散形成浓度梯度，抗原与抗体在比例合适的扩散部位相遇形成沉淀线的反应。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶（PAGE）等。最常用的方法为： 单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验将适当浓度的抗体混入琼脂凝胶中，琼脂凝固后，打成小孔。加入待测的抗原，使抗原在凝胶中由小孔自由向周围扩散，并合适的位置与抗体结合形成沉淀环。沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。双向免疫扩散试验在琼脂板上按一定距离打数个小孔，相邻的两孔内分别放入抗原和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出

6、现沉淀线。常用于抗原或抗体的定性检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析。Ag1Ag1Ag1Ag1Ag2Ag4Ag1+Ag2免疫电泳技术 (immuno-electrophoresis)是电泳分析与沉淀反应的结合产物。加快了沉淀反应的速度。利用蛋白质其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应。免疫电泳包括: 血清免疫电泳 对流免疫电泳 火箭电泳 免疫印迹 （Western blot） 血清免疫电泳将抗原混合物（病人血清）在凝胶中用电泳分离。沿电泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示病人血清与正常人血清存在的差异，即血清蛋白组分的缺少或增加。火箭免疫电泳 称作单向电泳扩

7、散免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起来的一项定量技术，实质上是加速度的单向扩散。沉淀线的高度与抗原量成正比免疫标记技术是采用酶、荧光素、放射性核素等标记物标记抗原或抗体所进行的抗原抗体反应。免疫标记技术既可对样品作定性、定量检测，也可进行定位分析，且大大提高了方法的灵敏度，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。免疫标记技术 酶免疫技术 荧光免疫技术 放射免疫技术 化学发光免疫技术利用抗原抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化活性相结合的免疫检测技术。酶标记的抗原或抗体与待检标本中的相应成分特异性结合，根据酶作用底物后的颜色变化，酶标检测仪分析、判断结果。常用方法有酶联免疫吸附试验：和用于检测可溶性抗

8、原或抗体，酶免疫组化法：用于检测组织中或细胞表面的抗原。酶免疫测定法必要的试剂是在固相载体（通常为聚苯乙烯反应板）表面进行的抗原抗体反应。实验中常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP），底物为二苯基联苯胺。酶联免疫吸附试验（ELISA）：固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（标记物）酶作用的底物（显色剂）基本步骤包 被反 应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体洗 涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离底 物 显 色定性或定量的分析常见的检测方法夹心法（测定抗原）间接法（测定抗体）竞争法（测定抗原或抗体）捕获包被法（测定IgM抗体） BAS-ELISA法 间接法测抗体 (indire

9、ct ELISA)Ag?待检抗体 适用于测定二价或二价以上的大分子抗原， 不适用于测定半抗原及低于二价的小分子单价抗原。 双抗夹心法测抗原 (sandwich ELISA)Antibody coated wellAdd antigenAdd enzyme-conjugated secondary antibodyAdd substrate(s) and measure color 将Ab吸附在固相载体表面。 加入酶标Ag和待测Ag，竞争结合Ab；对照只加入酶标Ag。 加底物。 对照孔与样品孔底物降解量的差未知Ag量。竞争法测定抗原 (competitive ELISA)亲和素(avidin)是

10、一种糖蛋白，生物素(biotin)为小分子化合物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可提高ELISA的敏感度。 BAS-ELISA法BAS为生物素(biotin)亲和素(avidin)系统(system)BAS-ELISA法 固相支持物； 样品； 特异性IgG； 生物素化抗小鼠抗体（IgG-Biotin）； 辣根过氧化物酶HRP-亲和素（HRP-Avidin）； DAB显色液； 显色；Summary（ELISA） 用经荧光染料标记的抗体对细胞或组织内的蛋白质进行定性或定量研究的方法。用荧光显微镜观察荧

11、光的产生或荧光强度，以此判断抗原的存在、定位和分布情况。可对特定的蛋白质进行细胞或组织内的精确定位。免疫荧光技术有直接法和间接法等。免疫荧光技术AgY荧光素标记的特异性抗体组织切片AgYY荧光素标记的抗抗体组织切片第一抗体直接法间接法待测抗原待测抗原常用荧光染料：显示绿色荧光：FITC, GFP，Alexa-488显示红色荧光：Rhodamine B, Texas Red, PE， Alexa-546,568,594显示蓝色荧光：Alexa350 ，DAPI免疫荧光染色放射免疫分析（ radioimmunoassay, RIA ）将放射性同位素测量的高度灵敏性、精确性和抗原抗体反应的特异性相结

12、合的体外测定超微量物质的技术。通常是标记抗原与未标抗原竞争有限量的抗体，然后通过测定标记抗原抗体复合物中放射性强度的改变，测定出未标记抗原量。常用标记核素： 125 I 3 H 射 线 半衰期 60.2d 12.3y标记方法 简 单 复 杂标记设备 低 廉 昂 贵测量条件 简 单 复 杂 化学发光免疫分析 ( chemiluminescence immunoassay, CLIA） 将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合。 具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定且有效期长、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高。 高灵敏度的化学发光检测技术以被广大研究人员所

13、认可，并正逐渐替代传统的生物检测技术。 常用的化学发光底物：鲁米诺 (3, 2氨基邻苯二甲酰肼, lumino) 酶反应的底物是发光剂, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定，目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP）。 操作步骤与酶免分析完全相同: 以酶标记的抗原或抗体,进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物。酶标荧光放免发光灵敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9几种标记/检测技术灵敏度的比较酶标荧光放免发光有效期（月）1815129630几种标记/检测试剂的有效期比较020,00040,00060,00080,000100,000试剂盒仪器

14、特殊防护治理污染三种免疫测定技术的成本及费用放免酶标发光RMB淋巴细胞的检测检测免疫细胞的数量与功能，是判断机体免疫系统功能的重要指标 淋巴细胞数量: 淋巴细胞亚群检测 淋巴细胞功能: T淋巴细胞增殖试验 细胞毒试验 最常见的淋巴细胞亚群包括T细胞（ CD4+T细胞和CD8+T细胞）、B细胞、NK细胞。淋巴细胞亚群检测 淋巴细胞亚群检测通过抗体组合来进行检测，通常用流式细胞术检测（Flow Cytometry， FCM）。 检测机体细胞免疫功能的重要指标，且对某些疾病(如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等)的辅助诊断，分析发病机制，观察疗效及监测预后有重要意义。 联合C

15、D45三色方案：1.CD45/CD3/CD4 检测T3细胞和T4细胞。2.CD45/CD3/CD8 检测T3细胞和T8细胞。3.CD45/CD3/CD19 检测T3细胞和B细胞。4.CD45/CD3/CD16和/或CD56 检测T3细胞和NK细胞。常用方案： 联合CD45的四色方案： 1. CD45/CD3/CD4/CD8 检测T3细胞和T4/T8细胞。 2. CD45/CD3/CD19/CD16和(或)CD56 检测T3细胞和B细胞。双色方案：1.CD3/CD4 检测T3细胞和T4细胞。2.CD3/CD8 检测T3细胞和T8细胞。3.CD3/CD19 检测T3细胞和B细胞。4.CD3/CD1

16、6和/或CD56 检测T3细胞和NK细胞。淋巴细胞群单核巨噬细胞嗜碱性细胞粒细胞流式细胞术检测（Flow Cytometry， FCM）联合CD45的四色方案： 1.CD45/CD3/CD4/CD8 检测T3细胞和T4/T8细胞。 2.CD45/CD3/CD19/CD16和(或)CD56 检测T3细胞和B细胞或NK细胞CD45/CD3/CD4 CD45/CD3/CD8 CD45/CD3/CD19 CD45/CD3/CD16+CD56 联合CD45的四色方案： CD4淋巴细胞减少：见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷病、艾滋病、应用免疫抑制剂的患者。 CD8淋巴细胞增多：见于自身免疫病，如SLE、慢性活

17、动性肝炎、病毒感染等。 CD4/CD8比值异常：比值降低的：艾滋病患者比值显著降低、 SLE肾病、传染性单核细胞增多症、急性巨细胞病毒感染、骨髓移植恢复期等。比值增高见于类风湿性关节炎、I型糖尿病等。 用于监测器官移植的排斥反应，若移植后CD4/CD8较移植前明显增加，则可能发生排异反应。临床意义淋巴细胞功能 判断机体细胞免疫或体液免疫功能,为了解疾病的发病机制,判断病情与预后,观察疗效提供有价值的依据 T淋巴细胞增殖试验 细胞毒试验 T淋巴细胞增殖试验3H-TdR 掺人法:人外周血T淋巴细胞在PHA刺激下发生母细胞转化而增殖，处于S期的T细胞摄取胸腺嘧啶核苷（TdR）用以合成DNA。3H标记

18、的TdR不断地被摄入细胞内，通过放射性计数测量方法，了解淋巴细胞增殖情况和机体的细胞免疫功能。MTT 比色法:噻唑兰（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT），是带正电荷的化合物染料，具有细胞膜渗透性。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源进入的MTT还原为深蓝色MTT-甲臜结晶，它不能穿透细胞膜，因此沉积在处于增殖且未受损伤的细胞内。其生成量与活细胞数目成正比，用以评估细胞存活状况。细胞毒试验51Cr释放法乳酸脱氢酶(LDH)法Na2 51CrO4能进入到靶细胞内，与细胞浆蛋白质牢固地结合。当标记的51Cr细胞受到CTL或NK细胞损伤后，即可释放出 51Cr，辐射射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中的 射线（51Cr），即可计算出CTL或NK细胞活性。LDH在胞质内含量丰富，细胞处于正常状态下其不能通过细