用甘油作保护剂制备胆固醇三联酶液及胆固醇试剂的推广应用

1、用甘油作保护剂制备胆固醇三联酶液及胆固醇试剂的推广应用用酶试剂测定血清总胆固醇(t)是if推荐的方法，县有简易、快速、精细，特异性好，适应于自动或半自动生化分析仪及各类分光光度计等优点，在我国正在逐步取代强酸显色剂。全面推广使用t酶法分析，胆固醇酯酶(eh)和胆固醇氧化酶(d)需要有优质，价廉，充足的供给来源。上海医药工业研究院及河北省科学院微生物研究所研制的这两种酶，虽可到达常规生化检验的要求，但不能满足供给，所以我们引进了behinger公司eh、d，用甘油作保护剂制备了胆固醇三联酶液，设计以trinder反响。)为根底的改良的t测定法。液体胆固醇酶试剂减少了在制备过程中(如冻干球磨)酶活

2、性的损失，保证了酶试剂质量，降低了本钱。材料和方法1.酶及试剂(1)eh、d系西德behringer产品，eh13300u/g(25)，d3580/g(25)；辣根过氧化物酶(hrp，r11.52)上海华美生物工程公司产品，200u/ng(25)。(2)kh2p4、na2hp4、12h2及酚类均为喻尔滨市化工试剂厂产品；聚乙二醇辛基醚(乳化剂p)为东湖塘化学试剂厂；4-氨基安替比林(4aap)为上海试剂一广产品；甘油为吉林省军区化工厂产品；胆酸钠为serra产品；胆固醇亚油酸酯为siga产品，纯度99。(3)作比照研究用的酶试剂有美国beran、意大利sdar胆固醇试剂盒。2.仪器岛律lkb-

3、260紫外分光光度计，il公司-10，a全自动生化分析仪及美国enr离心式自动生化分析仪；上海县曹行无线电原件厂81.2型磁力恒温搅样器。3.实试方法(1)试剂配方选择：三联酶液：每升甘油pbs(ph7.2)酶稀释液中含eh750u，d750u,hrp5000u，在2-8环境中磁力搅拌2小时，分装安瓶(1l/瓶)，在-20环境中可保存2年，在2-8环境中可保存半年。根底缓冲液：每升kh2p4-na2hp4缓冲液中(ph7.2，2l/l)含胆酸钠3l；4aap0.5l，0.5p乳化剂及适当的防腐剂。酚试剂：每升无离子水中含苯酚3l(1.5/瓶)。标准液：bek水溶性胆固醇标准液(5.2l/l)。

4、(2)t测定：将三联酶液与酚试剂，基质缓冲液按1：1.5：60比例混合，放置10分钟待用。测定t时血清及标准液与t酶试剂按1：75比例混合，37保温11.5分钟后，以光度计测吸光度(波长505n)。假设用离心式自动生化分析仪，三联酶液，酶试剂及基质缓冲液2：1.5：60比例混合，血清与试剂比例不变(1：75)(3)米氏常数(k)的测定：胆固醇亚油酸酯作底物，浓度为810-3-14.510-3l/l，在d足够的条件下与eh作用时在波长240n检测+胆甾稀酮的生成速度。以反响初速度与底物浓度按双倒数法(lineearerburk法)作图求k值。实验结果1.酶促反响的速度及显色稳定性在酶偶联反响过程

5、中，反响速度主戛取决于扁动酶(eh)的特性，采用充足的d和hrp活力与适宜的显色反响条件，按离心式自动生化分析仪所选那么的试剂与血清比例混合37环境6分钟反响已到达终点，其吸光度在60分钟内可保持不变。而bekan、sdav试剂反响到达终点的时间分别为3分、5分。2.温度对反响速度的影响用behringereh与d所制备酶试剂显色反响在3755范围内随温度升高(25、30、37、40、45、50、55)而速度加快(15.8、6、6、5、4、3、5分钟)自终点吸光度一样(a0.452-0.471/505n)。3.behringereh的k值为测准胆固醇亚油酸酯水解速度不用hrp及显色剂，减少eh

6、用量，直接测定胆固醇的氧化产物+胆甾烯酮，由此测出此酶的k为6.2810-5。4.胆固醇三联酶液保护剂的选择乙二醇和甘油作为质控血清的标定剂，甘油作硷性磷酸酶的保护剂均早巳有报导，z二醇作稳定剂得美国专利后被广泛采用。甘油又称丙三醇，与乙二醇化学性质相近，并有相似的粘质和吸水特性，甘油取材方便。用甘油作三联酶液的保护剂，三联酶液在-20环境保存致少可稳定2年，在-2可稳定6个月。5.酶激活剂的作用胆盐和镁离子均是eh激活剂，由于我们采用pbs，参加镁离子可形成不溶性沉淀，故本试剂中只加少量的胆酸钠。外表活性剂聚乙二醇辛基苯基醚有使样品中胆固醇酯从酯蛋白颗粒中释放出来的作用，参加少量能促进酶反响

7、，但用量超过0.5时对酶有抑制作用。6.线性实验血清中t在12.7l/l以下与本系统反响的吸光度变化有良好的线性关系，回归方程y=5.810-3+1.31，与bekan试剂根本一致。7.精细度与回收试验t测定批内，批间v均2。血清参加胆固醇1.07、2、15、3、24、4.078l/l后，回收率分别为102.88、103.55、103.84、95.03，平均回收率为102.0。8.比照实验采用同一份标本，用本文试剂与某些进口试剂比照结果见表3。可见p0.01本试剂与进口试剂无显著性差异。讨论1.本法在测定血清t中的应用本文参考if推荐的方法，酶法检测血清中t浓度是国外普遍采用的方法之一，具有标本量少，精细度较高的特点。同时本法还有方法简单，操作方便，不需特殊仪器，不污染环境等优点，实为目前条件下可推广使用的一种可靠的t定量检测手段。2.t酶试剂的推广应用ehd的质量，价格及充足的来源是能否全面推广应用t酶方法分析的关键，引进behringerehd用甘油作保护剂制备胆固醇三联酶液，配制过程中在低温条件下用恒温磁力搅拌器混合，对酶的活性损失很少。三联酶液在-20低温下保存致少可稳定二年，在28环境中可稳定6个月。保证了酶试剂质量，降低了酶试剂本钱。测定t时显色反响在6分钟到达终点，血清t浓度在12.7l/l以下线性良好；准确度试验平均回收率102.07；