生物芯片分类及应用

1、一、概念、分类及应用1生物芯片分类及应用第1页（一）、 两 个 概 念生物芯片 主要指经过平面微细加工技术在固体芯片表面构建微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其它生物组分准确、快速、大信息量检测。基因芯片 技术是经过微阵列技术, 将高密度DNA片段阵列经过高速机器人以一定次序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标识DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量基因表示及监测等方面研究最新革命性技术。2生物芯片分类及应用第2页微阵列芯片（Microarray）微型试验室芯片(Lab-on-a-chip)液体芯片(Liquichip)（二）、生物芯片分类及应用3生物芯片分类

2、及应用第3页Lab-on-a-chip 微型试验室芯片是经过在芯片上刻成微流路径从而将包括生物检测主要步骤样品准备/生化反应/结果检测整合在一张芯片上。4生物芯片分类及应用第4页5生物芯片分类及应用第5页6生物芯片分类及应用第6页Liquichip Bead , Capture molecule , Analyte , Reporter molecule是组成liquichip 4个主要部分。Bead上带有两种荧光，依据这两种荧光百分比能够 将bead分为各种。当前已经有48种，正在开发中。Capture molecule : 作用相当于探针，能特异性与被检测物结合。Analyte: 样品中被

3、检测成份。Reporter molecule: 带有荧光汇报分子，能特异性与被检测物结合。7生物芯片分类及应用第7页Liquichip反应普通步骤： 1.先将capture molecule 结合在bead 上， 2.将这种标识了bead与样品反应。Capture molecule 能够与对应 analyte 特异性结合， 3.此时再加入荧光标识，特异结合analytereporter molecule。 4.检测：用liquichip workstation 进行检测。原理是同时对bead和reporter molecule 上荧光进行检测。从而确定被结合analyte种类和数量。 8生物芯

4、片分类及应用第8页Liquichip技术特点描述1基于bead这种固相反应技术，含有 灵敏度高、信号强度高、灵活性好、所需样品量少特点。2与传统蛋白芯片相比，有两大优势，反应速度更加快，灵活性更加好。3因为检测方法特点，在大部分试验过程中，都不需要洗脱步骤，省时，且不会破坏反应动态平衡。4有配套蛋白表示和纯化体系。（his-tag） 9生物芯片分类及应用第9页Lquichip应 用 领 域：蛋白质定量蛋白质功效研究蛋白表示谱分析。蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸相互作用研究。包含：免疫分析、酶分析、受体-配基分析、蛋白质核酸相互作用分析分析。 10生物芯片分类及应用第10页微阵列芯片蛋白芯片基因芯

5、片 11生物芯片分类及应用第11页蛋白芯片(Protein Chips)高通量微阵列蛋白分析方法 利用抗体抗原结合原理，采取化学发光或荧光检测 标识抗体或抗原，来检测抗原或抗体。12生物芯片分类及应用第12页蛋白芯片应用免疫学分析 蛋白与蛋白之间相互作用 DNA与蛋白质分子相互作用13生物芯片分类及应用第13页基因芯片基因芯片是经过微阵列技术, 将高密度DNA片段阵列经过高速机器人以一定次序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标识DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量基因表示及监测等方面研究最新革命性技术。微阵列技术巨大优势在于它能够并行地宏量获取生物信息，借助此技术发展生物芯片

6、则提供了以核酸杂交为基础基因水平表示监控，多态性研究和基因分型。从而使我们对基因表示调控有更深入了解。14生物芯片分类及应用第14页基因芯片发展历史Southern & Northern BlotDot BlotMacroarrayMicroarray15生物芯片分类及应用第15页基因芯片 按内涵划分： cDNA芯片 Oligo芯片:25mer(affymetrix), 70mer(Operon)， 80mer（Clontech）, 按功效划分： 基因组芯片： 检测某一基因是否存在，若 存在，拷贝数是多少。探针是DNA. 表示谱芯片：确定基因表示路径与表示产 物。探针是RNA或cDNA 测序芯

7、片：经过探针与微阵列配对分析获 得探针序列结果。16生物芯片分类及应用第16页基因芯片应用基因表示检测多态性分析遗传图谱定位基因分型经过杂交反应测定序列17生物芯片分类及应用第17页基因芯片应用领域遗传疾病研究癌症家系遗传疾病普通基因突变疾病感染性疾病药品筛选动物植物遗传筛选育种 个人基因身份证环境监测18生物芯片分类及应用第18页（三）、生物芯片应用优势高通量平行分析样品自动化程度高省时省力所需样品试剂少保护环境成本低19生物芯片分类及应用第19页生物芯片应用优势生物信息数据累积为生物信息公共数据库添加更多数据有利于研究基因序列与生物表型之间关系有利于了解疾病发生机制20生物芯片分类及应用第

8、20页二、生物芯片制作技术介绍21生物芯片分类及应用第21页生物芯片制作方法分类22生物芯片分类及应用第22页 原位合成 (In Situ Synthesis)化学合成原子印章原位光刻合成23生物芯片分类及应用第23页原位光刻合成 美国著名Affymetrix企业率先开发寡聚核苷酸原位光刻专利技术，是生产高密度寡核苷酸基因芯片关键关键技术。24生物芯片分类及应用第24页 原位光刻合成原理Light directed oligonucleotide synthesis.A solid support is derivatized with a covalent linker molecule t

9、erminated with a photolabile protecting group. Light is directed through a mask to deprotect and activate selected sites, and protected nucleotides couple to the activated sites. The process is repeated, activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to

10、 be constructed at each site.25生物芯片分类及应用第25页预先合成后点样(off-chip synthesis)接触式点样非接触式点样26生物芯片分类及应用第26页基因芯片点样方式接触式点样-适合于DNA芯片制作 即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样品留在固相支持物上27生物芯片分类及应用第27页接触式点样Best!28生物芯片分类及应用第28页ArrayIt ChipMaker Pins带有细槽不锈钢针尖载样能力: 200 to 600 nL点样体积: 250 pL to 2.5 nL (pin size)点样直径: 100 m to 500 m (pi

11、n size)Dipping of pin for sample pickupTouching of slide with pin to leave spot Control print volume with pin size29生物芯片分类及应用第29页Stealth and Chipmaker Pin (TeleChem)30生物芯片分类及应用第30页Chipmaker 点样技术31生物芯片分类及应用第31页Stealth Pins32生物芯片分类及应用第32页CatalogNumberSpot Diameter(m)Uptake volume (l)Delivery Volume(nl

12、)Minimum spot spacing (m )Maximum subgrid per pin (spots)Density (spots/cm2)Maximum numberOf spots (18mm72mm)SMP390-1000.250.612036*366,35082,944SMP4120-1300.251.016028*283,84250,176SMP5150-1600.251.320022*222,37230,967SMP6180-1900.251.524018*181,58820,736SMP7200-2200.271.726016*161,25416,384SMP8210

13、-2300.281.827516*161,25416,384SMP9260-2900.282.034012*127069,216SMP10300-3300.292.340010*104906,40033生物芯片分类及应用第33页TeleChem企业点样针技术不停发展专利针技术共有30种针供选择与斯坦福大学共同发展专利 pin, 带样稳定，样品利用率高单次带样可连续点样达200-1500次特殊不锈钢材料，适合用于各种溶液实际点样直径75-250um,可依据不一样品选择对应pin相当轻易更换pin和pin head以适应不一样需要34生物芯片分类及应用第34页基因芯片点样方式非接触式点样-适合于蛋

14、白芯片制作 它是以电磁阀或压电原理将样品直接喷至固相支持物表面35生物芯片分类及应用第35页非接触式喷点技术ThermalSolenoid螺线管PiezoelectricDP36生物芯片分类及应用第36页Synquad：经过高分辨率注射器泵和微螺线管阀门有机结合起来准确控制滴液 Piezoelectric：用压电晶体将液体从孔中喷出压电技术，两个压电晶体同时加脉冲通电触发这两个压电晶体往喷管中间变形挤压喷管侧壁，喷管出现收缩压迫液体从喷嘴喷出。 DP37生物芯片分类及应用第37页非接触式点样：synQUAD Technology38生物芯片分类及应用第38页Aspirate and Print

15、 for Making Arrays39生物芯片分类及应用第39页Characteristics of synQUAD TechnologyWide dispense rangeLow nanoliter to high microliterExcellent linearityPrecise and accurateCVs typically less than 10%Precision less than 5%Non-contact dispense mechanismEasier mechanical alignment (384, 1536,)“On-the-fly” printing

16、 possibleCapable of dispensing onto membranes or slidesMultiple liquid handling modesAspirate/DispenseContinuous Reagent Dispensing40生物芯片分类及应用第40页synQUAD vs Piezoelectric PrintingsynQUAD / nQUAD Patented by Cartesian Uses commercially available components Robust and reliable delivery mechanism Low n

17、anoliter to low microliter dispense volume maximum density: 200 to 400 spots/cm2 Piezoelectric Abbott holds key patents on technology Dispense susceptible to air bubbles Mid-picoliter dispense volume 2500 spots/cm241生物芯片分类及应用第41页三、生物芯片检测系统CCD扫描仪 非共聚焦激光扫描仪激光共聚焦扫描仪42生物芯片分类及应用第42页数值孔径与采光效率NA 0.3 NA 0.8

18、NA = sin(), where is the angle of the cone43生物芯片分类及应用第43页激光共聚焦（聚焦）The fluorescence source is at the objective lens focusLight goes through the pinhole to the detector44生物芯片分类及应用第44页激光共聚焦（非聚焦）Fluorescence source below focus (e.g. out of focus)Out of focus light is mostly blocked at the pinhole45生物芯片分

19、类及应用第45页Confocal Artifact RejectionNo Pinhole With PinholeDust artifacts reduced by at least a factor of 1046生物芯片分类及应用第46页CCD Camera SystemsAdvantages: Few moving partsFast scanning of bright samplesDisadvantages: NA limited to about 0.40: Less appropriate for dim samplesOptical scatter can limit pe

20、rformanceNeed to “stitch” together large imagesConfocal Laser ScannersAdvantagesSmall depth of focus reduces artifactshigh light collection efficiency. PMT detectors have the highest sensitivity in the visible range47生物芯片分类及应用第47页DNAscope LM+ 激光共聚焦芯片扫描仪48生物芯片分类及应用第48页xxyzxMACROscopeFilters49生物芯片分类及应

21、用第49页How the Scan System Works F-theta Telecentric Scan SystemSampleScanning MirrorLaser Scan LensBAC50生物芯片分类及应用第50页How to scan a whole sampleHome SensorScanning MirrorSampleLaser Scan Lens51生物芯片分类及应用第51页DNAscope LM+ 优点 共聚焦面积宽 : 20mm70mm能够扫描各种介质 (Images both Glass Slide Microarrays and CLONDIAG AT t

22、ubes)背景噪声低，信噪比高全自动成像，分析结果 Small footprint (W20cm x L30cm x H20cm)52生物芯片分类及应用第52页Imaging Arrays Both Dry & WetDryPBSbufferCy3 Cy5Cy3 and Cy5 labeled protein dotted on glass substrate and imaged at 5 micron resolution in both dry and wet formats53生物芯片分类及应用第53页Tube 1Tube 2Cy3 Images of two Clondiag Arr

23、ay Tubes 54生物芯片分类及应用第54页四、生物芯片技术思绪比较55生物芯片分类及应用第55页Comparison of DNA Chip Technologies Sensitivity of DNA chip based assays is a function of:Probe and target DNA/RNA (Complexity)Chip surface (autofluorescence & non-spec. bkg)Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency & crosshyb.)Hybridization

24、 efficiency (lots of factors)Detection technology (signal type, efficiency, noise) Oligo-Chip cDNA-Chip Genomic Chip 20n or 80 n 50,000 nsequencingexpressionexpressiongenomic analysis56生物芯片分类及应用第56页cDNA芯片缺点因为不一样基因长短不一样，Tm值各异，成千上万基因在同一张芯片上杂交，使得杂交条件极难同一。同一个体中总是存在一些基因家族同源序列，加上有物种存在基因重合序列相互干扰，使得传统cDNA芯片

25、分辨能力受到限制，结果准确性也受到影响。有些组织中在DNA双链中无意义链中存在重合基因；而且不一样RNA剪切方式等基因表示方式极难用cDNA芯片来区分。PCR产物是结合稳定DNA双链，加入探针后在杂交中必定存在竞争性抑制，影响探针和模板结合能力和稳定性，深入影响cDNA芯片分辨能力和结果可信度，这对于低丰度基因影响尤为显著。PCR产物浓度不均一也可能造成错误结论。 57生物芯片分类及应用第57页寡核苷酸芯片比cDNA芯片优点 探针序列经过系统优化，降低非特异杂交，能有效区分有同源序列基因；降低二级结构 及其对杂交结果影响杂交温度均一，提升杂交效率；合成产物浓度均一，防止因样品浓度差异而造成点样

26、量差异 ；能够设计检测不一样剪切方式基因；无需扩增，预防扩增失败影响试验 。58生物芯片分类及应用第58页预合成后点样系统综合成本cDNA芯片方法/步骤 试剂/仪器（万） 人员（人） 耗时（月） 构建或购置基因文库 1-31-2 3-6 PCR引物设计与合成55-65万 （个片段）1 3PCR产物纯化及定量1.2/20 （个片段1 2点样 点样仪60万 1 3天 杂交 0.3万试剂 1 2扫描 扫描仪60万 1 1-2累计 197.5 209.56-7 11-15 59生物芯片分类及应用第59页预合成后点样系统综合成本自己合成寡聚核苷酸芯片方法/步骤试剂/仪器（万）人员（人）耗时（月）寡聚核苷

27、酸筛选及合成 (个基因)200（每个基因用1个70碱基寡核苷酸片段代替，合成1个碱基14元人民币计）。1(寡核苷酸片段筛选，还需专业软件)3-4个月，如购置DNA合成仪，成本？，但时间较长点样 点样仪60万 1 1个月 杂交 0.3万试剂 1 2个月 扫描 扫描仪60万1 1-2个月 总计320.3万47-960生物芯片分类及应用第60页预合成后点样系统综合成本应用Operon探针寡聚核苷酸芯片方法/步骤 试剂/仪器（万）人员（人）耗时（月）探针100点样 60（点样仪）1 1 杂交 0.3（试剂） 1 2扫描 60（扫描仪）1 1-2总计220.334-561生物芯片分类及应用第61页Aff

28、ymetrix技术平台综合成本芯片万杂交小时洗涤小时扫描分钟累计220万小时62生物芯片分类及应用第62页总结采取Affymetrix企业生物芯片系统平台比较适合于实力雄厚科研试验室，能够在最短时间内尽快取得准确可靠而且可能是前人未曾取得试验结果，并可在国际权威杂志上获发表，尽快在相关研究领域在国际领域占领一席之地。 63生物芯片分类及应用第63页总结采取合成后点样生物芯片平台比较适合于目标定位于研发、生产试验室及生物企业。即使购置芯片点样扫描系统经费看起来比购置Affymetrix系统费用要低，研发方向能够结合试验室研究特点，比较灵活，但前期研究需要投入较大人力、物力和时间，综合成本并不低，

29、而且取得芯片信息量小，可靠性较低，使用该系统生产芯片为材料进行研究普通为验证性工作，且因为材料可靠性低，极难在国际权威杂志上取得认可。当前开发生产生物芯片尚无取得医疗许可产品。64生物芯片分类及应用第64页五、生物芯片制作所需耗材65生物芯片分类及应用第65页 Microarraying Accessories（芯片配件）Pins and PrintheadsOmniGrid Slides and ReagentsOmniGrid Epoxy(环氧基修饰)OmniGrid Amine(氨基修饰)OmniGrid Aldehyde(醛基修饰)Complete line of associated reagentsHybridization ChambersHybChamberHybChamber Mica66生物芯片分类及应用第66页Slides:Ep