褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的神经细丝过度磷酸化的影响及机制

1、褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的神经细丝过分磷酸化的影响及机制【关键词】阿尔茨海默病摘要：目的探究褪黑素(el)对花萼海绵诱癌素(A)在成神经瘤细胞诱导的神经细丝过分磷酸化中的影响及其机制。要领接纳鼠野生型成神经瘤细胞(N2at)，赐与A处置惩罚，或同时赐与差异浓度el或维生素E(VitE)处置惩罚，并用免疫印迹法检测神经细丝磷酸化水安然平静卵白磷酸酯酶2A(PP2A)含量，32P特异底物标识表记标帜技能检测PP2A活性。效果A可在N2at细胞引起神经细丝过分磷酸化，同时伴有PP2A含量和活性低落。el对A引起的神经细丝过分磷酸化有庇护作用，且强于VitE；el同时对抗A诱导的PP2A活性和含量低

2、落。结论el可通过调治细胞内PP2A的含量和活性而减轻A引起的神经细丝过分磷酸化。关键词：阿尔茨海默病；花萼海绵诱癌素；褪黑素；神经细丝；过分磷酸化KEYRDS:AlzhEiersdisease;alyulinA;elatnin;neurfilaent;hyperphsphrylatin阿尔茨海默病(Alzheiersdisease,AD)是一种以举行性影象减退和认知成效停滞为重要临床病症的神经退行性疾病，神经原纤维缠结(neurfibrillarytangles,NFTs)是其重要病理特性之一。NFTs重要由非常过分磷酸化的tau卵白构成，tau卵白作为细胞内的重要骨架卵白，对微管组装、维持

3、微管不变性都具有紧张作用。神经细丝(neurfilaent，NF)是骨架卵白中的中心丝，由低(NFL)、中(NF)、高(NFH)分子量的三种亚基构成，它与微管、微管相干卵白(包罗tau卵白在内)等其他骨架卵白存在普及的彼此作用，并配合维持着细胞骨架的正常布局。Nany等证明非常过分磷酸化的神经细丝也是NFTs的紧张构成身分，因此其在AD发病机制中的作用也日益受到器重。褪黑素(elatnin，el)是由松果体排泄的一种具有多种生物学成效的内排泄激素，随着年事的增长其排泄量渐渐落落。研究创造AD患者脑脊液中el的程度明显低于同年事正凡人群，临床上AD患者赐与el后，可以改进某些患者的认知成效。因此

4、，el排泄紊乱在AD的发病历程中大概起紧张作用。比来有人报道，el可阻断或逆转冈田酸(kadaiaid,A)在神经瘤细胞(N1E115)引起的氧化应激、细胞凋亡和微管粉碎。我们曾报道el可对抗花萼海绵诱癌素(alyulinA,A)在SY5Y细胞引起的神经细丝过分磷酸化。为进一步研究el对抗A引起的神经细丝过分磷酸化的机制，我们别离用el和维生素E(vitainE,VitE)与A同时处置惩罚成神经瘤细胞N2at，用免疫印迹法检测神经细丝磷酸化水安然平静PP2A含量，免疫标识表记标帜技能检测PP2A活性。效果创造el和VitE可对抗A引起的神经细丝过分磷酸化，同时el对抗A引起的PP2A活性低落和

5、含量低落。本实行进一步展现了el和VitE对抗A诱导的神经细丝磷酸化的机制。1质料与要领1.1重要试剂DE、ptiE、胎牛血清(FBS)购自美国Gibi公司；丙烯酰胺(Ar)、N，N亚甲叉双丙烯酰胺(Bis)、四甲基乙二胺(TEED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸(Glyine)、小牛血明净卵白(BSA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、el、VitE均为美国Siga公司产物；过硫酸铵(AP)、二喹啉甲酸(BA)卵白检测试剂盒购自美国Piere公司；硝酸纤维素膜(N膜)为Hybnd公司产物；单克隆抗体SI31(识别磷酸化的NFH、NF，15000)、SI32(识别非磷酸化的NFH、NF，15

6、000)、R123d(识别PP2A的催化亚单元，11500)购自Sternberger公司，所用抗体稀释液为50g/L脱脂奶粉，TBS/T配制；辣根过氧化物酶标识表记标帜的二抗和EL显色体系购自Santaruz公司；A购自美国Biheial公司；32PATP购自北京亚辉生物医药公司。1.2细胞造就鼠野生型成神经瘤细胞贴壁生长细胞株(N2at)由许华熙传授(TheBurnhaInstitute,LaJlla,alifrnia,USA)提供，细胞用含50g/L胎牛血清(FBS)的DE/ptiE(11)造就基，在5%(体积分数)2、37造就箱内举行造就，每2-3d调换造就液一次，细胞达约70%-80

7、%品貌时，传代或用于实行。给药处置惩罚前，细胞用无血清造就基造就12h诱导分化。细胞分为6组：正常比拟组，参加含DS(0.01%体积分数)的造就基；A组，参加5nl/LA；25l/Lel组，参加5nl/LA同时参加25l/Lel；50l/Lel组，参加5nl/LA同时参加50l/Lel；100l/Lel组，参加5nl/LA同时参加100l/Lel；VitE组，参加5nl/LA同时参加50l/LVitE。1.3卵白质印迹阐发按上述分组加药处置惩罚细胞12h后，弃造就基，预冷的PBS洗2次，参加细胞裂解液90L(50l/LTrislpH8.0，150l/LNal,10L/LTritn，1g/LSD

8、S，0.2g/LNaN3，100g/LPSF，1g/Laprtinin，PSF和aprtinin临用前参加)，在冰上静置10in，用细胞刮刮起细胞并转移到EP管中，参加4加样缓冲液30L，煮沸10in，超声破裂(35s)，12000g离心10in，取上清。取样品参加各个泳道(包管各泳道参加的样品卵白总量为10g)，卵白质经7.5%SDSPAGE凝胶电泳分散后被转移至N膜上；N膜用50g/L脱脂牛奶室温关闭1h，别离参加单克隆抗体SI31、SI32，R123d，4孵育留宿，然后用含1g/LTeen20的TBS(TTBS)漂洗(35in)；再参加得当稀释的辣根过氧化物酶标识表记标帜的二抗，37孵育

9、1h，TTBS漂洗(35in)；参加EL显色液，显色1in，停顿显色并将胶片置于N膜上，在暗室里曝光30s，免疫印迹效果扫描后用图象阐发体系阐发。1.4PP2A活性测定根据Gng等的要领。在磷酸化缓冲液(单元：l/L，TrisHl40、pH8.5,E20，al20.2，gl215)中，磷酸化酶b(Phb，2g/L)和0.5l/L32PATP及10g/L磷酸化酶激酶(PhK)，在30孵育10in后，Phb被磷酸化为Pha并有一部门被32P标识表记标帜；32P标识表记标帜的磷酸化酶a(32PPha)经SephadexG50柱与游离ATP(Free32P)分散，网络组分中32PPha的放射性/(Fr

10、ee32P的放射性+32PPha的放射性)100%95%作为PP2A的底物。PP2A催化32PPha开释出32P，根据32P的开释量可判断PP2A的活性。反响体系总体积20L，含Tris50l/L、pH7.0，BE10l/L，EDTA0.1l/L，affeine7.5l/L，7.5g/L32PPha和0.06g/L细胞提取物及0.2g/L按捺因子1(PP1的特异性按捺剂)，反响以参加32PPha开始，30举行30in，参加10L停顿液(4l/LATP、200g/L三氯乙酸溶解)停顿反响，取7L反响混淆物点到层析纸上，开释出的32P在50g/L三氯乙酸(0.2l/LNal溶解)层析液中通过上行色

11、谱法与底物分散。然后用erenkv液闪仪举行闪耀计数阐发。1.5统计学处置惩罚实行数据以s表现，接纳SPSS10.0统计阐发软件行方差阐发，以P0.05为差异有明显性。2效果2.1el和VitE对A诱导的神经细丝磷酸化的影响本研究用识别磷酸化的神经细丝(NFH，NF)的抗体SI31和识别非磷酸化的神经细丝(NFH，NF)的抗体检测神经细丝的磷酸化状态。神经细丝的免疫印迹效果表现：A处置惩罚后SI31显色明显加强(图1A)，而SI32显色明显削弱(图1B)；25、50、100l/Lel和VitE使SI31显色削弱(图1A)，SI32显色加强(图1B)。图象阐发效果进一步表现：el在50l/L时对

12、神经细丝的磷酸化的庇护作用最强，且比同浓度的VitE的作用更强。效果提示A处置惩罚12h后N2at细胞的神经细丝产生了磷酸化，el和VitE对A诱导的神经细丝的磷酸化有庇护作用。图1el和VitE对A诱导的神经细丝磷酸化的影响略2.2el和VitE对A引起的PP2A活性变革的影响我们从前报道了el对A和A引起的神经细丝的过分磷酸化都有庇护作用4,7，因此我们推测el对骨架卵白磷酸化的庇护作用大概与其升高PP2A活性有关。为了进一步探究el对A引起的神经细丝过分磷酸化的庇护机制，我们用32P特异底物标识表记标帜技能检测PP2A活性。效果表现：A组细胞内PP2A活性与正常比拟组比拟明显低落(P0.

13、01)；25、50、100l/Lel处置惩罚组的PP2A活性与A组比拟均明显升高(P0.01)，但随el浓度升高，PP2A活性升高程度低落；VitE组的PP2A活性与A组比拟明显低落(P0.01)。效果提示低、中、高浓度el对A诱导的PP2A活性低落均有庇护作用，而VitE对之无庇护作用(图2)。图2el和VitE对A诱导的PP2A活性低落的影响略2.3el和VitE对A引起的细胞内PP2A含量的影响为进一步探究el对抗A引起的PP2A活性低落的机制。我们用识别PP2A的单克隆抗体R123d检测细胞内PP2A含量。效果创造：A组的R123d显色较正常比拟组削弱(P0.01)；25l/Lel组和

14、50l/Lel组的R123d显色强于A组(P0.01)；100l/Lel组和VitE组的R123d显色与A组比拟无统计学差异(P0.05)。效果表白A明显低落细胞内PP2A程度，25、50l/Lel可部门对抗A引起的细胞内PP2A程度低落(图3)。图3el和VitE对A诱导的PP2A含量低落的影响略3讨论我国粹者曾报道AD患者脑和脑脊液中磷酸化的NFH和NF程度明显升高，PP2A和PP1的特异性按捺剂A处置惩罚人神经瘤细胞SY5Y后，细胞出现了相似的效果。比来，我们创造PP2A和PP1的另一种按捺剂A处置惩罚SY5Y细胞也可引起神经细丝过分磷酸化。在本实行中，我们创造A处置惩罚N2at细胞后，

15、细胞内神经细丝产生过分磷酸化，PP2A含量明显低落，但PP2A活性轻度低落。我们曾报道A处置惩罚后，细胞内出现显着的氧化应激和脂质过氧化，同时细胞内GSK3活性明显升高。根据报道，脂质过氧化产物可激活GSK3引起tau卵白过分磷酸化，我们以为A引起神经细丝过分磷酸化的机理不但与其低落PP2A含量和PP2A活性有关，并且还与其促进氧化应激有关。el既具有脂溶性，也具有水溶性，轻易通过血脑屏蔽进着迷经细胞。研究表白，el可逆转或阻断A引起的氧化应激、细胞凋亡、骨架卵白粉碎。在本实行中，我们创造低、中、高浓度el均可部门对抗A引起的神经细丝过分磷酸化，但高浓度el的对抗作用比低、中浓度的作用弱；同时，el还可升高PP2A活性，但随el浓度升高，其升高PP2A活性的作用削弱；VitE虽低落PP2A活性，但也可部门对抗A诱导的神经细丝过分磷酸化。我们推测其大概原由于：VitE部门对抗A引起的氧化应激和脂质过氧化，从而对抗A引起的GSK3活性升高；同时VitE低落PP2A活性，又使Ser9磷酸化的GSK3去磷酸化淘汰，从而Ser9磷酸化的GSK3占总GSK3的比例升高，GSK3活性低于正常，进而规复GSK3/PP2A平衡，对抗A引起的神经细丝过分磷酸化。详细机制尚需