负载MMP-2siRNA阳离子脂质体的制备及体外转染肝星状细

1、中国科技论文在线中国科技论文在线- FORMTEXT Preparation of cationic liposomes delivering MMP-2 siRNA and its transfection study of hepatic stellate cells in vitro FORMTEXT LIU Feng1, FORMTEXT CHEN Pingshen2(1. Department of Pathology and Pathophysiology, Medical School, Southeast University, Nanjing, 210009;2. Depar

2、tment of Pathology and Pathophysiology,Medical School,Southeast University, Nanjing, 210009)Abstract: FORMTEXT Objective: To explore the preparation method and characteristics of cationic liposomes delivering siRNA and evaluate its toxicity, transfection efficiency and gene silencing efficiency on h

3、epatic stellate cells. Methods: The cationic liposomes were prepared by film dispersion and high pressure homogenizer method. TEM, ZETA-SIZER were used to characterize cationic liposomes. Transfect HSC in vitro and evaluate its toxicity, transfection activity and gene silencing efficiency. Results:

4、The average diameter of cationic liposomes was about 133.9 nm and the average zeta potential was 41.67mV. Transfect HSC in vitro showed that it has low cytotoxicity, high transfection activity, and the three siRNA of gene silencing efficiency is50.6%、40.0%、53.4%. The mRNA expression and enzymatic ac

5、tivity of MMP-2 in HSC-T6 was significant declined after treated with MMP-2 siRNA. Conclusion: Cationic liposomes which have smaller particle size, good stability, low toxicity and high gene silencing efficiency can be successfully prepared by these methods. This study provides an effective tool to

6、siRNA interference experiments. Key words: FORMTEXT pathology; cationic liposomes；siRNA; hepatic stellate cells; matrix metalloproteinase-2; transfection activity引言RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种由siRNA或miRNA引起其同源mRNA特异性降解而导致基因表达沉默的现象。与其他抑制基因表达的方法相比，siRNA技术具有特异、高效和持久等特点，且操作简单相对安全，所以其研究和应用现已成为基因治疗研究的

7、热点，同时该技术也为一些临床疾病的基因治疗开辟了一条新途径。然而，目前运输siRNA的载体并不完善，普遍存在转染效率低、毒性大等问题。其中阳离子脂质体作为一种非病毒载体，具有无免疫原性、可自然降解等优点，近年来备受研究者关注。但是，阳离子脂质体在介导基因转染方面仍存在许多问题，如在不同细胞、不同结构配比下转染效率不同等。HSC细胞活化是肝纤维化发生发展的中心环节，肝内基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）主要由HSCs产生，MMP-2对该细胞活化起促进作用，在肝纤维化的发生发展及逆转中都起重要作用，在肝纤维化发展的不同时期，干预MMP-2的表达

8、，对肝纤维化的治疗具有重要的临床意义。本实验中，我们成功制备了阳离子脂质体，对其体外理化性质进行了考察，并评价了负载MMP-2 siRNA后其对HSC的细胞毒性、转染效率及基因沉默效率，为后续HSC细胞的RNA干扰实验研究提供可靠参考。1 材料与方法1.1 试剂和仪器胆固醇 (北京奥博星生物技术责任有限公司)，3-N-( N,N-二甲基胺乙基)胺基甲酰基胆固醇(3-N-( N,N- dimethylaminoethane) carbamoyl cholesterol, DC-Chol, Sigma, 美国)，二油酰磷脂酰乙醇胺(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho

9、ethanolamine, DOPE, Sigma, 美国), MMP-2-siRNA(上海吉玛制药技术有限公司)，其余均为化学纯。旋转蒸发仪 (河南巩义英裕子华仪器厂)，超声波清洗器 (上海超声波仪器厂) H2600透射电子显微镜 (Hitachi, 日本)，ZETA SIZER 3000 激 光 粒 度 分 析 仪(MALVERN, 英国)，高压均质机 (Avestin, 加拿大)，荧光显微镜（Nikon, 日本）。肝星状细胞株HSC-T6（大鼠源性）为本实验室保存。1.2 实验方法1.2.1 阳离子脂质体制备 将DC-Chol、DOPE、胆固醇按摩尔比4:3:3混合置于圆底烧瓶，加入适量

10、氯仿-甲醇（3:2, v/v）溶液水浴超声振荡5min，使其中物质充分溶解混匀，37水浴旋转蒸发除去有机溶剂，使脂材在瓶壁上形成一层均匀薄膜；加20ml pH 7.2的1PBS缓冲液，高速搅拌30min，待薄膜完全脱落后探头超声1min，经220m滤膜反复挤压34次，41.2.2 阳离子脂质体的表征 将制备的阳离子脂质体悬液稀释至适当倍数，滴有膜铜网，观察其外观形态。用 ZETA SIZER 3000激光粒度分析仪进行粒径测定，应用动态光散射软件进行数据处理，记录平均粒径、多分散性指数。阳离子脂质体稳定性考察：将阳离子脂质体在4静置两个月后，1.2.3 MMP-2 siRNA设计 从Genba

11、nk中选取大鼠MMP-2 mRNA序列，采用siRNA Target Designer- Version 1.51设计软件设计3对MMP-2 siRNA及1对阴性对照序列，序列见表1。表1 MMP-2特异性siRNA序列及阴性对照序列Tab. 1 MMP-2 specific siRNA sequence and negative control siRNA sequence序列名称序列（5-3）靶位点MMP-2-rat-608sense strand GUGGCCAACUACAACUUCUTTantisense strand AGAAGUUGUAGUUGGCCACTT608-628MMP-2

12、-rat-2061sense strand GGAGAUACAAUGAAGUAAATTantisense strand UUUACUUCAUUGUAUCUCCTT2061-2081MMP-2-rat-2171sense strand GGUGGUCACAGCUAUUUCUTTantisense strand AGAAAUAGCUGUGACCACCTT2171-2191Negative controlsense strand UUCUCCGAACGUGUCACGUTTantisense strand ACGUGACACGUUCGGAGAATT1.2.4 阳离子脂质体siRNA结合能力检测 将阳离

13、子脂质体与siRNA分别按0：1、1：1、3：1、5：1、7：1、9：1、15：1的质量比结合（终体积50L，其中siRNA的浓度恒定为0.01g/L），室温混匀后静置30min，以便充分反应形成复合物。琼脂糖凝胶电泳检测阳离子脂质体siRNA结合情况。1.2.5 阳离子脂质体/siRNA复合物细胞毒性的考察 采用MTT比色法测定阳离子脂质体对HSC-T6细胞的毒性。选取处于对数生长期的HSC-T6细胞，以5103/孔接种于96孔板，在37、5%CO2条件下培养24h。实验组每孔中分别加入不同质量比的阳离子脂质体/siRNA复合物（siRNA恒定为浓度为30mM）和Opti-MEM培养液共20

14、0L，阴性对照组加入opti-MEM培养液，用Lipofectamine 2000作为阳性对照组。每组设6个复孔，于37、5%CO细胞存活率=A试验孔/A对照孔100%1.2.6 阳离子脂质体/siRNA复合物转染效率分析 HSC-T6以3105/孔接种于6孔板中，待细胞生长密度约为50% 60%时，弃上清，向各个孔中加入不同质量比的阳离子脂质体-FAM-siRNA复合物（siRNA恒定浓度为30mM）混悬液0.2mL及opti-MEM培养液1.8mL，每组设3个复孔，用Lipofectamine 2000加FAM-siRNA作为阳性对照组，阴性对照则用裸露FAM-siRNA直接进行转染。6h

15、后荧光显微镜观察其转染效率。1.2.7 基因沉默效率实验 将阳离子脂质体与MMP-2-siRNA按质量比5:1混匀（siRNA浓度30nM），体外转染HSC-T6，36h后提取总RNA，检测MMP-2 mRNA表达。MMP-2引物1：正义链为5- CATCGTACTCCTCGTTGCTGATCCACAT-3，反义链为5-CTCCCTCATGCCATCCTG CGTCTG-3，扩增片段长度为228 bp。内参GAPDH引物2：正义链为5- GAAGGGCTCATGACCACAGT-3，反义链为5-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3，扩增片段长度为117 bp。MM-2扩增反应条件：94

16、5 min，9430 s，62.530 s，721.2.8 siRNA靶向干扰不同时间对MMP-2 mRNA表达及MMP-2酶活性的影响 阳离子脂质体包裹MMP-2 siRNA转染HSC-T6，6h后更换无血清培养基，分别在12h、24h、36h、48h、72h收获细胞并收集上清，提取RNA，RT-RCR检测MMP-2 mRNA表达情况，上清用超滤管浓缩并蛋白定量后，做明胶酶谱检查。各时间点设3个复孔，以未进行转染的同条件培养作为对照组。1.2.9 统计学处理 采用SPSS 13.0软件做统计分析，数据用xs表示，组间比较用独立样本t检验，P0.05表示差异有统计学意义。2 结果2.1 阳离子

17、脂质体形态 本法制备的空白阳离子脂质体为白色乳状液，略带蓝色乳光。透射电镜下观察发现，阳离子脂质体分散性良好，大部分为单室脂质体，近似球形，粒径分布范围在100200nm间（图1）。4图 1 空白阳离子脂质体电镜图片Fig. 1 Shape of cationic liposomes observed by TEM2.2 阳离子脂质体粒径及zeta电位测定ZETA SIZER 3000激光粒度分析仪测定结果显示：阳离子脂质体平均粒径在133.9 nm左右，单峰状，多分散指数为0.167，粒径分布范围窄，分布均匀（图2）。其平均zeta电位为41.67mV，脂质体带正电荷，具有较好的稳定性。图2

18、 阳离子脂质体激光粒度分析仪结果Fig. 2 ZETA SIZER result of cationic liposomes2.3 阳离子脂质体siRNA结合能力 琼脂糖凝胶电泳显示，随着阳离子脂质体量的增加，其siRNA包裹能力增强，从5:1开始，阳离子脂质体便能将siRNA完全包裹（图3）。1 DC-Chol/ siRNA=1:0，2 DC-Chol/ siRNA=1:1，3 DC-Chol/ siRNA=3:1，4 DC-Chol/ siRNA=5:1，5 DC-Chol/ siRNA=7:1，6 DC-Chol/ siRNA=9:1，2 DC-Chol/ siRNA=15:1图3 不同

19、质量比的阳离子脂质体/siRNA复合物凝胶阻滞实验Fig. 3 Electrophoretic results of compound of liposome with siRNA in different proportions2.4阳离子脂质体/siRNA复合物的细胞毒性 阳离子脂质体/siRNA复合物对HSC-T6存在一定的毒性，但不十分明显，且阳离子脂质体的细胞毒性与DC-Chol浓度成正比，当DC-Chol/ siRNA高达20:1时，细胞存活率仍在80%（图4）。图4 不同DC-Chol/siRNA对HSC的细胞毒性Fig. 4 Toxicity of liposomes to H

20、SC cells with different DC-Chol concentrations2.5 细胞转染 以商品化的转染试剂和裸露siRNA直接转染作为对照，评价了阳离子脂质体/siRNA复合物在HSC-T6细胞中的体外转染效率。裸露siRNA直接转染组细胞中观察不到绿色荧光，不同比例阳离子脂质体/siRNA混合物对HSC-T6细胞转染，6h后荧光显微镜下均观察到细胞胞体内有绿色荧光（图5)，其中当DC-Chol/ siRNA=5时转染效率最高，转染效率为72.4%，高于和低于此比例转染效率均低于5:1组，且随着质量比升高细胞毒性也随之升高。A：Lipofectamine 2000转染组

21、B：DC-Chol/ siRNA=5转染组 C：裸露siRNA转染组图5 荧光显微镜下HSC-T6转染效率的观察Fig. 5 Transfection efficiency observed by fluorescence microscope2.6 基因沉默效率转染36h后，各组MMP-2相对于内参的灰度比值分别为1.310.05、1.270.08、0.640.03、0.780.05、0.610.03，各干扰组与空白对照组之间mRNA表达差异有统计学意义（P0.05），且3组siRNA干扰效率分别是50.6%、40.0%、53.4%（图6）。图6 转染36h后HSC-T6 MMP-2 mRN

22、A表达变化Fig. 6 MMP-2 mRNA expression changes after 36h transfection2.7 siRNA靶向干扰不同时间对MMP-2 mRNA表达及MMP-2酶活性的影响MMP-2 siRNA靶向干扰不同时间后，MMP-2 mRNA表达情况如图7所示：转染12h后目的基因表达没有明显变化，从24h后表达下调，在干扰48h后目的基因表达量降到最低，而后表达上调。明胶酶谱检测干扰前后MMP-2蛋白酶活性变化，结果显示，MMP-2 siRNA靶向干扰后，酶活性显著下降（P0.05），且在干扰48h后酶活性降到最低，与RT-PCR结果相符（图8）。A正常对照组

23、不同时间MMP-2 mRNA RT-PCR电泳图； B干扰不同时间后MMP-2 mRNA RT-PCR电泳图图7 转染不同时间后 MMP-2 mRNA相对表达量Fig. 7 MMP-2 mRNA expression changes after different transfection time图8 转染不同时间后MMP-2活性变化Fig. 8 MMP-2 enzymatic activity changes after different transfection time3 讨论阳离子脂质体通常由阳离子脂质和中性磷脂组成，两种成分结合可形成稳定的双层膜结构，同时可降低阳离子脂质的毒性。

24、DOPE是目前应用最广泛的中性磷脂，具有很强的细胞去稳定化作用，诱导脂质体膜与体内膜融合，从而快速释放外源基因3。目前文献上报道的阳离子脂质体多由DOTAP或DC-Chol与DOPE按一定比例制备而成，本实验中阳离子脂质体由DC-Chol、DOPE、胆固醇按比例制成，胆固醇加入阳离子脂质体双层中，可生成极具活力的复合物，除能抵抗血清的抑制作用外，还可以借助于改善细胞与复合物的结合和摄取，显著提高转染效率4。超声可以使脂质体粒径变小，将大多室脂质体变为小单室脂质体，我们在实验中，将形成的薄膜高速搅拌水化之后，间歇式探头超声1min，制成的脂质体粒径均在200nm以下，且粒径分布范围窄，分散均匀。

25、zeta电位的大小影响脂质体混悬液的稳定性，带电脂质体能够减少相互间的聚集和融合，增加稳定性，当zeta电位绝对值小于30 mV时，荷电粒子不稳定，容易发生聚集5。本实验制备的脂质体的zeta电位为41.67mV，因此比较稳定，4阳离子脂质体与核酸的比例是影响基因转染效率的重要因素之一。siRNA在体外很不稳定易受核酸酶的降解，阳离子脂质体可通过静电作用与之结合，形成阳离子脂质体/siRNA复合物，将siRNA压缩包进脂质体囊泡中，从而利于被细胞摄取并免于被核酸酶降解。本研究结果显示当DC-Chol/ siRNA大于5:1时，siRNA被阳离子脂质体完全包裹。体外细胞转染结果表明当DC-Cho

26、l/ siRNA等于5时转染效率最高，用此比例转染时基因沉默效率均在50%左右。siRNA干扰不同时间后，MMP-2基因表达及酶活性均显著降低，且在干扰48h时，基因表达量及酶活性降到最低。阳离子脂质体作为外源基因的载体，具有制备简单、毒性低、无免疫原性、转移的核酸大小范围广（从寡核苷酸到染色体均可）、可被机体降解等优点，因此成为目前基因治疗应用最广泛的非病毒类载体之一6。虽然阳离子脂质体具有明显的基因转染功能，但也存在很多不确定性，如在不同细胞、不同转染时间、不同结构及比例等情况下，转染效率不同，说明阳离子脂质体介导的基因转染受多方面因素影响7。因此需要对阳离子脂质体的制备、基因转染等条件进行进一步优化，以获得最佳结果。本实验制备了负载MMP-2 siRNA阳离子脂质体，制备方法简单，粒径均一，在保证转染效率的同时，对HSC-T6细胞毒性较小，为以后的MMP-2 siRNA干扰实验研究提供了一个有效的工具。参考文献 (References) FORMTEXT 1 李静, 陈平圣. 缺氧肝细胞对肝星状细胞基质金属蛋白酶-2表达及活性水平的影响J.东南大学学报（医学版）,2010,29(3):272-2752 Jing Li, Renhua Fan, Susu