中科大【生物化学与分子生物学实验原理】重组蛋白的SDS-PAGE

1、实验八 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量李卫芳 汪文捷 王秀海1 实验目的1.1 通过本实验学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的基本原理。1.2 初步掌握应用此法测定蛋白质分子量的操作技术。1.3 掌握考马斯亮蓝染色技术。 纸电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳毛细管电泳NativeSDSIEF2DClassification2 实验原理SDSPAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳），1967年由Shapiro等建立1969年由Weber和Osborn进一步完善用于测蛋白质亚基分子量 SDS电泳系统中引入了SDS和还原剂，如-巯基乙醇和二硫苏糖醇（DTT） 。SDS 是一种阴离子

2、去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，使蛋白去折叠变性，多聚体解聚为亚基。还原剂能断开链内和链间二硫键，使蛋白质以单链形式存在。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成蛋白质-SDS复合物。其形状为长椭圆棒状，短轴的长度都一样，约为18 ，而长轴长度与蛋白质分子量成正比。 在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1 g蛋白质SDS的硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷，大大超过蛋白质分子原有的电荷，因而屏蔽了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异，从而使蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而

3、与所带电荷和形状无关，这样便能直接从电泳迁移率计算出蛋白质的分子量。 凝胶浓度与孔径的关系：T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大。T浓度小，孔径大，移动颗粒穿过网孔阻力小。凝胶浓度与被分离物分子量的关系： 由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒的分子量也不同.在分子量15 KD-200 KD范围内，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，即：lgMW = K- bmRMW 为蛋白质分子量K为截距b为斜率mR为相对迁移率在一定条件下，K和b均为常数相对迁移率 =根据上述方程将已知分子量的标准蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图，可制出一条标准曲线，测出同样条件下待测蛋白质的电泳迁移率，即

4、可从标准曲线上查出其分子量本法测定分子量的误差约为10%。考马斯亮蓝命名是为纪念1896年被英国占领的阿散提部落首府Kumasie（Coomassie）。染色最早由Fazekas等在1963年用于醋酸纤维素膜电泳，并认为同样可用于纸电泳，琼脂糖电泳和淀粉凝胶电泳。1965年Meyer等将此方法应用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。 考马斯亮蓝染色技术考马斯亮蓝是一种氨基三苯甲烷染料，通过范德华力与NH3+的静电引力，与蛋白质形成紧密而非共价结合的复合物。R-250即三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含有两个SO3H基团，偏酸性，与氨基黑一样结合到蛋白质的碱性基团上。G-250即二甲花青亮蓝，呈蓝绿色，是一种甲基

5、取代的三苯基甲烷。使用时，考马斯亮蓝在甲醇-冰醋酸-水 （50：10：40， V/V）混合液中的浓度通常为0.05%0.1%，而且应该在加冰醋酸和水之前将它们先溶于甲醇。灵敏度：考马斯亮蓝染色可以达到0.2 0.5 g（200 500 ng），最低可检出0.1 g蛋白；通过考染条带的深浅粗细，可以大致判断该条带有多少蛋白。银染的灵敏度比考染高将近100倍，最低可以检出2 ng蛋白。蛋白质完全变性二硫键全部还原与SDS充分结合 样品处理目前使用最多的是Laemmli的Tris-甘氨酸系统，广泛地用于蛋白质亚基分子量以及纯度的测定。蛋白质的二硫键是否完全被还原。只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原

6、的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。所以样品处理时需加-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）。样品处理液中SDS单体的浓度:为了保证蛋白质与SDS的充分结合，溶液中SDS的总量至少要比蛋白质高3-4倍，甚至10倍以上。样品处理液的离子强度：应保持较低的离子强度（低于0.26），这样才能保证SDS有较高的单体浓度，与蛋白质充分结合。若样品的离子强度太高，需先透析或凝胶过滤除盐。样品中的蛋白质浓度需适当。浓度过高，易造成拖尾，甚至影响蛋白质迁移率与分子量对数的线性关系；浓度太低则不易检测。通常根据样品含有的蛋白质种类多少及所使用的检测方法确定蛋白质浓度，如用考马斯亮蓝染

7、色，每种蛋白的浓度应为2030g/ml,若用银染，则只需0.30.5g/ml。二硫苏糖醇（DTT） 0.75g(或-巯基乙醇) 1ml10%SDS 10 ml1M Tris-Cl pH6.8 1.6 ml87%甘油 6.25 g0.05%溴酚蓝 2mlddH2O 至20ml1 ml/管分装，20保存。 样品缓冲液（0.08M Tris-Cl， pH6.8） 5用样品缓冲液（0.08M Tris-Cl， pH6.8）配制成每种标准蛋白质浓度均为0.5 g /ul的溶液，-20保存。使用前置室温融化后，沸水浴中加热3-5分钟后上样。配置贮备溶液 A30%Acr/0.8%Bis 贮液： Acr30

8、g Bis0.8 g溶于去离子水，定容至100 ml。棕色瓶4保存。B.4分离胶缓冲液（1.5 M Tris-Cl pH 8.8；0.4% SDS）：Tris Base：181.8 g； SDS：4 g； ddH2O 750 mlHCl 加至pH 8.8ddH2O 至 1000 mlC.4浓缩胶缓冲液（1M Tris-Cl pH6.8 ；0.4% SDS ）：Tris Base：30.3 g； SDS：4 g； ddH2O 200 mlHCl 加至pH6.8 ddH2O 至250 mlD.10 % AP：AP 1gddH2O 至10 mlE.TEMEDF.10SDS电极缓冲液(PH8.3)：T

9、ris base (FW121.1) 250 mMGlycine (FW 75.1) 2MSDS (FW288.4) 1% (W/V) ddH2O to 100mL G.固定染色液：考马斯亮蓝R-250 0.58g 95%乙醇 250mL冰醋酸 50 ml ddH2O 200 ml L.脱色液：95%乙醇 250 ml冰醋酸 80 ml ddH2O1000 ml3.1 安装垂直板电泳槽3.2 分离胶制备12%, 配5 ml,加至距梳齿0.5 cm，上覆盖12 mm高的蒸馏水(或无水乙醇、水饱和的异丁醇) ，用于隔绝空气，使胶面平整，静置20 分钟-30 分钟使其聚合。3.3 浓缩胶制备5%，配

10、 2 ml,插入加样梳，静置20 分钟-30 分钟使其凝合。3. 试验操作试剂用量 (mL)12%分离胶5%浓缩胶4分离胶缓冲液(PH8.8)1.254浓缩胶缓冲液(PH6.7)0.530% 丙烯酰胺贮液20.33ddH2O1.71.1510% 过硫酸胺（AP）0.050.02TEMED0.0050.0023.4 上样与电泳 将电泳槽与电泳仪连接好， 上槽接负极，下槽接正极。 上下槽中加满电极缓冲液， 移液枪或微量注射器加样，每孔10 l。 电泳条件：开始电压90 V,待样品进入分离胶时，恒压130 V，电泳约2 h,直至前沿距下端约0.2 cm。加样：标准蛋白 (marker)：5 lE.C

11、oli lysis ：10 lPurified protein (OpuCC): 10 l注意：10 l电泳样品加入2.5 l 5Loading Buffer(5LB)后，要在沸水浴中煮35 min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。 3.5 凝胶板剥离与固定 电泳结束后，关闭电泳仪。用不锈钢药铲撬开玻璃板，取出胶膜。4.7 染色与脱色 加入染色液，微波炉内煮沸 1.5-2 min；or 室温下染色1 h；Or 60 水浴染色10 min。然后用脱色液脱色，更换脱色液3-4次，直至背景无色为止。4.1 电泳迁移率的计算4.2 标准曲线的制作 以各标准蛋白的相对迁移率为横坐标，分子量的对数为纵坐标绘制标准曲线。4.3 待测