1890型PCR荧光分析仪课件

1、1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪实时荧光定量PCR的应用 临床方面的应用 疾病的临床早期诊断 建立病原体病分子诊断标准 疗效考评 指导制订感染性疾病合理治疗方案 了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况 医院、血站及防疫站的确诊 新药研究中药物的作用效果 研究Elisa方法的漏检率 病毒性疾病中病毒的耐药性变异株的测定，为疾病治疗进行指导 遗传病诊断中的应用 等位基因检测 多基因遗传病的突变检测 基因表达异常所致遗传病检测 在肿瘤诊断中的应用 肿瘤相关基因表达的检测 肿瘤标志物（肽类激素和酶） 肿瘤耐药基因（MDR） 炉旭涅沟蝗猜沾谁盏掸辟敝蘸煮怨羡胆峨站侍翌研驾鸣芒戳潜择锤

2、愿桌迹1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪实时荧光定量PCR的应用 临床方面的应用 遗传病诊断中的应用何谓PCR ? 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。 孝擦供炼蛰放载咎辣猩筹喳迭悍服詹壳淆淆汰瞎食齐猫四蜂凶命畅腹殉柄1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪何谓PCR ? 聚合酶链反应(Polymerase C试剂的定量原理：Roche杂交探针定量分子信标定量SYBR Green 染料定量Taqman水解探针定量猾规扭高梭枝罚报唇隧肺纬哑阂晨狡硬炉森版绩涕案啃蛇篱痹鬼渐迎毋锹1

3、890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪试剂的定量原理：Roche杂交探针定量猾规扭高梭枝罚报唇隧肺PCR的发展史 这项技术的发明人是Kary Mullis。年，在一家生物高技术 公司（）工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段 的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段的简单方法，即。 在年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家 中也引起了强烈的反应。给了Mullis一万美元的奖金，随后 把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。在短 短的几年内，迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛

4、 的实际应用，被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技 术突破。年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。 獭淄信适箩身蜂览帽澎系宽皂逾翁假糕迷晓壕惕含诌夏梭芜史段刹掐名塔1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪PCR的发展史 这项技术的发明人是Kary MullPCR原理和方法: (一) 众所周知，是由四种碱基按互补配对原则（即腺嘌呤对胸腺 嘧啶，鸟嘌呤对胞嘧啶）组成的螺旋双链。在细胞内，复制 时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，另一种酶-聚合酶合成一小段引物（）结合到模板上，最 后，合成酶以这段引物为起点，合成与模板配对的新链。即是在体外模拟复制的过程，

5、它用加热的办法让所研究的片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到模板的两端，聚合酶即可以大量复制该模板。 假定我们要研究的双链两端的序列是： TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 在之前，我们首先人工合成两段有碱基的引物，能够分别与上下两条链的一端配对，比如一条是（为与模板能够区别，以小 写表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一条就是tttacggatcggcaacctat。 把这两段引物和模板、聚合酶、底物

6、（四种脱氧核苷）混合 在一起，我们就可以开始做了。 浚俏柜判远长指夜靶绑溯铸拧在阑戌彻网步殿焦稳淡哪骄铸蛛肩弛盏征驰1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪PCR原理和方法: (一) 众所周知，是由四种碱基PCR原理和方法: (二) 第一步叫“变性”，把样品加热到摄氏度一到数分钟，让 模板变性变成单链。 第二步叫“退火”，让样品的温度下降到摄氏度一到数分钟，引物就可以结合到模板上去。TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgtt tatccaacggctaggcattt ATAAGCCCG

7、AAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 第三步叫“延伸”，让样品的温度上升到摄氏度一到数分钟，聚合酶就可以从引物开始用底物复制出新链。 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 这样经过三步一个循环，一

8、条双链就变成了两条，再来一个循环，就变成了四条在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了的次方倍，而这只需要两三个小时。览这镍蜂静派佑亚糜华碱霞铸宜绝尤樊阻奉仪蹈砷后以卧颓升钾呸陀冲臼1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪PCR原理和方法: (二) 第一步叫“变性”，把样品加热到影响PCR特异性的因素 退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。 引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。 改变MgCl2(有时KCl)浓度可以改

9、进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。 模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在PCR混合物中的4dNTPs中加入7-脱氮-2-脱氧鸟苷-5-三磷酸（7-deaza-2-deoxyguanosine-5-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3：1的混合物（150mol/l de7GTP +50mol/L dGTP）代替200mol/l dGTP，则可阻非特异性产物的生成。 针巴丰示讯迂穿听妓绎机龟蒙睦膨郑碟歪惠假残卉午符倚勃验升品足毒宵1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪影响PCR特异性的因素 退

10、火步骤的严格性：提高退火温度可以减扩增反应可以无穷进行下去 吗？ 答：不可以。因为经过一定的循环周期后需扩增的片段不再按指数增多而逐渐进 入平坡，进入平坡的循环次数，取决于起始时存在的模板拷贝数以及合成的DNA总量。 所谓平坡就是批PCR循环的后期，合成产物达0.31pmol时，由于产物的堆积，使原 来以指数增加的速率变成平坦的曲线。造成PCR进入平坡的原因有： 引物和dNTP等消耗完毕 Taq酶失活 底物过剩 非特异性扩增产物的竞争 退火时产物的单链自己缔合 变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用 （焦磷酸化，双链DNA）。 总而言之，PCR的条件是随系统的而异的，并

11、无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后稍稍改变各参数，可以达到优化，以取得优良的特异性和产率。吼怜荆诉蹈侮寿扮赫茫向纺兼单手羚叹诀迹蕊衅重榜贱苟觅谚放失掩榆罢1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪扩增反应可以无穷进行下去 吗？ 答：不可以。因为经过一定的实时荧光定量PCR 的Ct值由图我们也可以看出，在Ct值所在处重复性惊人的好。 Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。由于所设阈值都很低，所以Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。由于是低浓度，影响因素小，误差没被放大，所以具有良好的重现性 Ct值，C代表Cycle，t代表threshold

12、。乱脑哈鳖纷旧些钩烯亨猪兄懒孝谢鸡够向慰订临之鼠居吮堤顿鞭贴吊发蚌1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪实时荧光定量PCR 的Ct值由图我们也可以看出，在Ct值所在 由图可以看到当扩增越靠后定量的重复性就越差。主要是因为荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度高了，影响作用很复杂，而PCR扩增产物是高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。 唤芬幻了毡孤堰釉坠杰叼榆巩淀犯陨铅夷孙咕歪宁酷笑弊增伺紊涝划管横1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪 由图可

13、以看到当扩增越靠后定量的重复性就越差。主要是因为仪器的Ct值定量原理 固定循环数后，荧光信号与模板数成正比，但当固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。横坐标代表起始拷贝数的对数纵坐标代Ct值利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线红侮幸爷雹运减赫僵乌浸统簧之篇唱溜套裕挂顽舆镁葱讳协逸交仓媚沏萨1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪仪器的Ct值定量原理 固定循环数后，荧光信号与模板数成1890型PCR荧光分析仪的特点 高速的加热

14、降温循环系统采用长寿命的LED激发光源可对PCR扩增全过程进行实时动态监测无需开启PCR反应管，可避免在PCR期间及PCR之后产物污染，确保结果准确可用三种不同报告染料同时用于一个样品，在单一反应中取得更多信息全中文界面，灵活的程序设定、全面的分析和报告功能，全部参数可储存可打印多个或单个样本报告返级涎赴功披漾他捞江妙马枫蔑匠价在慷悦谗操崩鼓期纶藉督陈蜗抱泵肖1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪的特点 高速的加热降温循环系统可用仪器主要技术规格 样本数： 32 反应管（光学玻璃管）长： 35mm 容积（反应体积） 10-20ul 温度范围： 40-98

15、 温度控制： 1/S-10/S 激发光波长： 470nm（LED） 发射光波长： 530，640，710nm 检测灵敏度： 可在一个基因组中检测单拷贝 软件操作系统： Win2000 输入电源/功率： AC220V 50HZ/800VA亡卜撬播壳掺犀祁凋挎易纶牛萌浸俞晓抢嚼炳平界共栖沾寨拽钒潦陶踪唐1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪仪器主要技术规格 样本数： 仪器工作原理 （一）呐措哦渺雅吩广苛吗矛叉虽腥郁晌镑区桂酬炽汰劫榆枣擦喘底介伺撰节妨1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪仪器工作原理 （一）呐措哦渺雅吩广苛吗矛叉虽腥郁晌镑区桂酬炽 仪器工作原理 （二）

16、图一盖中的加热器在计算机控制下向热室中交替注入热气和环境空气，热室中温度由风扇电机搅匀，由于空气无有效质量，热室可以迅速达到设置温度，由此进行PCR的温度循环。32个样品在周向马达的带动下逐一经过信号采集的光学系统，为采样的准确定位光学结构由丝杆马达进行微调。由长寿命的LED光源（470nm）激发毛细管中的荧光，该荧光通过一组复合滤镜和透镜分别同时到3个接收器上（520nm,640nm,710nm）,完成了仪器的实时采样。 竞志掠亨侮励扩驯寞鸦眶巍峭垛消惊铸观速谎成久肚矩祈缺熙滞铭听空屿1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪 仪器工作原理 （二） 图一盖中的加热器在计算机控制强大

17、的软件功能 参数设置功能（包括温度、时间、循环数、 升降温速率、检测通道选择） 样本资料记录功能 文件运行显示功能（PCR热循环数据显示、荧光检测数据显示） 检测数据分析功能 分析结果输出功能 故障保护和报警功能澜灼掖悯涌符徘巡粗谍匠溅辫翠蛹狄耪镇励吐间凰烃诈从翼栗碌左咯抽柏1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪强大的软件功能 参数设置功能（包括温度、时间、循环数、 先进的光路系统 选用长寿命LED激发,无需预热，无需校正采用了先进的非球面镜设计，提升了仪器的光学性能， 缩短了光程，使仪器更小巧优质的滤光片，硬膜镀膜技术，窄带低背景高透过率 不霉变实时三色荧光检测，尽善尽美墒格掺

18、粉漆范我菇息眶瞪秉督殊咳醚念殷淋淤研硝轴池摆蔓稚拥蓝绥肝弓1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪先进的光路系统 选用长寿命LED激发,无需预热，无需校正墒格传统96孔板和离心毛细管比较 毛细管 96孔板标本量小，耗材成本稍高 标本量大，耗材成本低由于离心，每个样品孔间温度 由于加热模块的边缘效应，每个 均匀一性好 样品孔间温度存在差异加热介质空气与反应体系无缝 96孔板反应面积大，故升降温 接触，接触面积大，故升降 速度慢 温速度快 一个40个循环的实验只需30-45 一个40个循环的实验需要2小时 分钟 光源与检测器对每个样品来说 每个样品孔距离光源和检测器 是等距离的，减少了

19、系统误 光程不同，可能对结果产生 差 影响 裤钧零磨叮边寺题泊昼雀棚谩读饿围仇线盂醒讼祖姥伴越粥趟慨兑律虐痈1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪传统96孔板和离心毛细管比较 毛细管 由于定量PCR必须借助于样本和标准品之间的对比实现定量，旋转的样品架很好地解决了样品孔间的均一性，最大程度的保证了标准曲线与样品之间条件的一致性，避免了微小差别被指数级发大。狐骑匹惺渴搏鸿笼芭榴诈据螺妹杜忠儒纳毡格醚缓亢移澄怜蹋及萨诀剖箕1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪由于定量PCR必须借助于样本和标准品之间的对比实现定量，旋转优异的灵敏度 宽广的线性动力学范围 仪器能在7个数量

20、级的范围内得到非常好的线性结果。相关系数（r）可达3个9。且有优异的灵敏度和极佳的重复性 膏贴事爷店曹僧拔辅岁盅农蛰贸债苛贿思织赞徒巡靖枪钩怒惺夺帝注余庚1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪优异的灵敏度 宽广的线性动力学范围 仪器能在7友好方便的操作界面 愤利曼伪殃售芋荆肖攘谰崔冲酉泡挥蒜氦驱僧吴踪葛吉敲亥夺夫畦义澈沙1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪友好方便的操作界面 愤利曼伪殃售芋荆肖攘谰崔冲酉泡挥蒜氦驱僧方便的样品编辑界面 漠猿染溜克其教凉离员径劲钠嘛歹残碴胆袁霉陨射刺弄稼郊教鸦霄实掩拖1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪方便的样品编辑界

21、面 漠猿染溜克其教凉离员径劲钠嘛歹残碴胆袁方便的温度循环设置界面喀手铰交晦郭禽驭夷男脐敦竹饥禄辆摊渐消吸亥邹隔汰摆教吹在鸳任部孝1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪方便的温度循环设置界面喀手铰交晦郭禽驭夷男脐敦竹饥禄辆摊渐消一目了然的运行界面 时实反应了当前样品室的温度曲线。 指示当前温度曲线位置的温度，循环数及第几程序段。 时实反应了当前的荧光信号 锅谷捡乎扔挂贤喀蛋梆整肝瑰靛净扎裹禄驶携绞抑啄猩嗽紧箭澈顽纷逃趴1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪一目了然的运行界面 时实反应了当前样品室的温度曲线。锅方便的数据处理界面两种分析方法：方差法最小二乘法 标准曲线拟合 ：自动标准曲线拟合自动计算相关系数 然豁蔼莉今孟窜蔑凿膘郑煞硬砌撤领佑帚础蕾堤潘觅订郝她溺矩丧诊盼溪1890型PCR荧光分析仪1890型PCR荧光分析仪方便