基因工程第二章基因克隆课件

1、2022/9/11苏州科技学院化学生物与材料工程学院 叶亚新第二章 基因克隆所需的工具酶 限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类-用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新第二章 基因克隆所需的工具酶 第一节 DNA的组成和结构DNA的组成DNA的空间结构DNA复制起始点和复制子的结构DNA转录启动子和转录区的结构2022/9/11苏州科技学院生物

2、系 叶亚新Chemical structures of the pyrimidines and purines that serve as the nitrogenous bases in RNA and DNA (b)Chemical ring structures of ribose and 2-deoxyribose, which serve as the pentose sugars in RNA and DNA respectively. 2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新Structures and names of the nucleosides and nucleot

3、ides of RNA and DNA.2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新Linkage of two nucleotides by the formation of a C-3C-5 (3-5) phosphodiester bond, producing a dinucleotide. (b) Shorthand notation for a polynucleotide chain. 2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新The top half of the figure shows computer-generated space-filling models of

4、B-DNA, A-DNA, and Z-DNA.2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新天然DNA的来源染色体DNA、病毒和噬菌体DNA、质粒DNA、线粒体和叶绿体DNA天然DNA的提取准备生物材料裂解细胞分离和抽提DNA第二节 天然DNA的制备2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶一 . 限制性内切酶的发现 1.细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，

5、1968年分离到I型限制酶。 2. 限制酶HindII的发现 HOSmith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。 3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制 D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。 第三节 限制性核酸内切酶和DNA片断化2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新1.I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上，三个基因构成

6、一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫氨酸）。2.II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在. coli中这两种基因位于质粒上。3.III型：修饰酶与型酶相同，hsd与hsd基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。 二、限制修饰系统的种类2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新）平齐末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 ）非互补的粘性末端 ）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG

7、()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13 ）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG四限制酶的特点2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制 酶 2. 特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG五. 异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新限制性核

8、酸内切酶作用机制2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新二、限制性核酸内切酶作用机制The restriction enzyme EcoRI recognizes and binds to the palindromic nucleotide sequence GAATTC. 2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新6、限制性内切酶的星号活性引起星号活性的可能因素甘油浓度过高离子强度不合适阳离子的变化溶液中PH值的变化在基因工程操作中，应避免星号反应的出现2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新二、限制酶的使用方法用限制酶消化DNA（酶切）是基因工程最基本的实验技术最常用的消化条件

9、：反应体积：20ul10 xBuffer：2ulDNA浓度：0.51.0ul2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新二、限制酶的使用方法1、影响限制酶消化DNA的若干因素DNA的纯度的影响DNA浓度的影响酶浓度的影响酶反应条件的影响双酶消化2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新影响限制酶消化DNA的若干因素DNA的纯度的影响限制酶作用于纯度不高的DNA时，会进行不完全酶解（部分酶切）RNA或其他DNA的污染影响小蛋白质污染并与DNA结合后，可能降低或终止酶切反应解决办法：用酚和氯仿抽提除去蛋白质2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新影响限制酶消化DNA的若干因素DNA的浓度的影

10、响DNA浓度过高带进更多的杂酶和杂质如限制酶量不足，可能引起部分酶切底物浓度过高，可能引起底物抑制2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新影响限制酶消化DNA的若干因素酶浓度的影响1 酶单位：是指在最适条件下完全消化1ug dsDNA所需要的酶量 用酶量过多，带进的杂质愈多，有可能增加Dnase 1的危险酶切设计时，甘油浓度不要超过52022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新影响限制酶消化DNA的若干因素酶反应条件的影响一般酶的反应条件：温度：37 PH：7.2 时间：2小时DNA酶切反应（控制反应时间）完全消化部分消化2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新影响限制酶消化DNA的若

11、干因素双酶消化反应条件相同：同时加到反应管，同时反应对温度要求不同：先低温消化，再高温消化对盐浓度要求不同：先低盐酶消化，再高盐酶消化2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新二、限制酶的使用方法2、单一限制酶酶切位点的创立 利用甲基化酶的修饰作用改变酶的识别序列，创造新的识别位点消除反应：某一种限制酶存在两种识别序列，如将其中一个序列中的某个碱基甲基化，使其不能被限制酶识别，从而使另一序列成为单一酶切位点邻近反应：与限制酶识别序列邻近的碱基有时作为某个甲基化酶的识别序列，而使其不再被限制酶所识别如BamH 1 ：GGATCC GGATCCGG2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新构建

12、DNA的物理图谱构建物理图谱的常用方法部分消化法基本原理：首先以某个酶对DNA进行完全消化，再进行部分消化： 部分消化的DNA大片段必定等于完全消化中相应部位的2个以上小片段之和。根据两类消化中片段大小的关系和交错重叠现象找出各片段的邻近位置，排出它们的顺序。 2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新某限制酶在一线型DNA分子上有三个切点：完全消化：A, B, C, D部分消化：BC, AD, ABC, D, ACD, B, AC, A, C推测其物理图谱。提示：从部分消化的结果中排除与完全消化相同的单一片段，然后根据剩余片段，推测其物理图谱从部分消化的结果中排除与完全消化相同的单一片段剩

13、余：BC, AD, ABC, ACD, AC推测其物理图谱为：BCAD2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新从细菌中分离了一个18.1Kb的线形DNA，用Ava完全消化得到8个片段，部分消化产生14个片段，求其物理图谱。完全消化片段：A (4.6), B (4.0), C (3.3), D (2.5), E (2.0), F (1.0), G (0.5), H (0.2)从部分消化的结果中排除与完全消化相同的单一片段剩余：6.6， 6.5， 5.3， 4.2， 3.8， 3.5， 0.7部分消化片段：6.6， 6.5， 5.3， 4.6， 4.2， 4.0， 3.8， 3.5， 3.3，

14、 2.5， 1.0， 0.7， 0.5， 0.22022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新构建DNA的物理图谱构建物理图谱的常用方法双酶消化法两个限制性内切酶先分别单独消化DNA的基础上，然后再同时或先后消化此DNA基本原理：单酶消化时的某些片段在双酶消化时可能仍然保留，另一些片断可能消失而出现新的片段，说明一个酶的切点 可能正好在另一个酶的片段之内。那么，新出现的2或3个片段的分子量之和必然等于那个消失的大片段：根据片段的大小找出消失片段与新生片段的关系，通过它们的交错重叠现象确定各片段间的邻近位置，组建出此DNA的物理图谱。 2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新用双酶消化法组建某

15、线型DNA的物理图谱用甲酶单独消化产生两个片段a , b用乙酶单独消化得到三个片段A , B , C用甲酶、乙酶混合消化得到四个片段：A, 1 , 2 , C试分析其相互关系。a b甲酶A B C乙酶A 1 2 C乙酶乙酶甲酶2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新从大肠杆菌分离到一个质粒DNA，用EcoRI，Hinc ，HpaI，SmaI进行单一和双酶消化，组建它们的物理图谱 2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新 根据片段的大小，将每一对酶的结果分别清理，除去在单酶和双酶消化时共同产生的片段，再按照分子量大小，找出新生小片段和一个消失大片段之间的关系 2022/9/11苏州科技学

16、院生物系 叶亚新第四节 其他工具酶一、E.coli DNA聚合酶（DNA pol ）E.coli 的DNA聚合酶系统Pol I 参与DNA修复, 具35和53外切酶活性pol II 同上 具35外切酶活性pol III 参与DNA复制,具35和53外切酶活性E.coli pol I的特点具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段, polIK)聚合酶活性，53, 要求3-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响（表6） 外切酶活性 2022/9/11苏州科技学院生物系

17、叶亚新一、E.coli DNA聚合酶（DNA pol ）5-3聚合酶活性催化单核甘酸结合到DNA模板的3OH末端5CCGOH DNApol 5CCGATAGCCT GGCTATCGGA Mg2+ GGCTATCGGA2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新一、E.coli DNA聚合酶（DNA pol ）3-5外切酶活性 从游离的3OH末端降解dsDNA成为单核甘酸，但是它解离掉的部分主要是未配对的ssDNA. (其对dsDNA的外切活性可被53多聚活性所抑制)5CCGTATCGGAOH DNApol 1 5CCG GGC Mg2+ GGC2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新一、E

18、.coli DNA聚合酶（DNA pol ）5-3外切酶活性 从5末端降解dsDNA成为单核甘酸， 5 GATAGCCT DNApol 1 5 TAGCCT 3 GGCTATCGGA Mg2+ 3 GGCTATCGGA 2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新E.coli DNA pol 在基因工程中的作用制备高比活的DNA探针（采用缺口平移技术）用于分子克隆DNA序列分析2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新二、DNA聚合酶大片断（Klenow酶）5-3聚合酶活性催化单核甘酸结合到DNA模板的3OH末端5CCGOH DNApol 1 5CCGATAGCCT GGCTATCGGA M

19、g2+ GGCTATCGGA2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新二、DNA聚合酶大片断（Klenow酶）3-5外切酶活性 作用底物主要是ssDNA. (其对dsDNA的外切活性由于受到聚合酶作用的阻碍大大降低)2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新二、DNA聚合酶大片断（Klenow酶）在基因工程中的作用用同位素标记DNA片断的3末端 当DNA经限制酶酶切产生5端伸出的末端时，可用Klenow酶催化，在3端标记上与5端伸出的碱基顺序互补的核甘酸，在此反应中应用的同位素必须是32P-dNTP2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新C T T A A 5G32P-dATPC T

20、T A A 5G A *A*Klenow酶C T T A A 5G32P-dATP32P-dTTPC T T A A 5G A *A* T * T * Klenow酶2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新二、DNA聚合酶大片断（Klenow酶）在基因工程中的作用用同位素标记DNA片断的3末端用Klenow酶可将5端伸出的末端填平为平末端在反向转录合成 cDNA 的实验中，用Klenow酶合成双链 cDNA,除去3端的单链末端 2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新三、T4 DNA 连接酶缺口(gap) 切口(nick) 断口(cut)3HO P53HO P5ds-DNA结构: 切口

21、, 缺口, 断口2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新三、T4 DNA 连接酶1. 特点：只连接ds -DNA分子，要求3-羟基和5-磷酸基 2. 用途： 1) 相同或相容粘性末端的连接 2) 平整末端的相连 DNA平端来源：限制酶作用结果; 限制酶与其它酶共同作用结果 。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多3. 抑制剂： PO43-5mM , NaCl25mM, Ca+0.1mM2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新5-AAGCTT-3 5-AOH PAGCTT-3 PAGCTT AOH3-TTCGAA-5 3-TTCGAP HOA-5 HOA TTCGAP 退火

22、 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 或 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 T4 DNA连接酶 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5 或 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5 T4 DNA连接酶的连接反应(两种插入方向) +2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新四、逆转录酶(依赖RNA的DNA聚合酶) 一种有效转录RNA成为DNA的酶，产物为

23、cDNA,（互补DNA）由两种亚基组成，带有聚合酶活性和外切酶活性。聚合酶作用以RNA和DNA 为模板，合成DNA mRNAcDNA ， sscDNAdscDNA.2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新四、逆转录酶(依赖RNA的DNA聚合酶)3外切核酸酶作用（RNase H） 从DNA.RNA的杂交链中特异性地降解RNA链，进而保留新合成的DNA链在基因工程中的作用用mRNA为模板合成单链cDNA，或以单链cDNA合成双链cDNA（制备cDNA库的常用方法）制备各种分子杂交的探针，用于检测DNA或RNA2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新五、核酸酶S I（单链特异的核酸酶）降解s

24、sDNA或ssRNA形成5磷酸末端的单核甘酸或寡核甘酸片断。在基因工程中的作用证明基因内部的间隔顺序在cDNA合成中切开cDNA双链的发夹构建新的质粒使用注意事项 1) 避免长时间反应，因最适酸性pH将导致DNA断裂或降解 2) 避免使用高浓度酶量，以免DNA被降解(因产生切口)2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新ExoIIIS1S1S1S1S1S1Poly(A)Poly(A)5555552022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新六、甲基化酶一. 甲基化酶的种类与识别顺序 1. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶 三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤： 在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同 MHpaI C mCGG HpaI C CGG 相同2022/9/11苏州科技学院生物系 叶亚新