生化技术第八章聚焦层析

1、第八章 聚焦层析(chromatofocusing)在离子交换和等电聚焦基础上发展起来的分离方法。原理：利用各混合组分等电点差异和离子交换行为分离电荷量不同的物质的方法。固定相：多缓冲交换剂 流动相：多缓冲液一、多缓冲交换剂和多缓冲溶液1.多缓冲交换剂（离子交换剂）基质为sephorose 6B ，其上有多种电荷基团，缓冲能力极强。主要类型：PBE94 pH范围4-9 PBE118 pH范围8-11均为阴离子交换剂2.多缓冲液流动相指在一定范围pH值条件下具有很强的缓冲能力。内含一系列精选的物质，各物质异同： 都含有-COOH和NH2； 都有PI ； PI相近，又相异（间隔很小）。如：poly

2、buffer96：各物质的pI在pH6-9范围，在此条件下，具有很强的缓冲能力。 polybuffer74：在pH4-7范围内有很强的缓冲能力。二、基本原理1.pH梯度的形成 当polybuffer（流动相）流入填充有PBE交换剂（固定相）的层析柱时，由于其移动的过程中，可与交换剂发生作用，即可使柱中自上而下形成pH梯度。例如：要形成pH6-9的下降梯度：首先，选择具有碱性基团的PBE 94阴离子交换剂（缓冲范围为pH9-6）；其次，用相应的起始缓冲液将其平衡至pH9（整个柱）再次，用含有pH6的polybuffer（流动相）淋洗柱体。 柱内发生何种变化？ 中和作用多缓冲液中的大部分酸性成分与

3、与阴离子交换剂的碱性基团结合。 结果：随淋洗过程的进行，柱内每一点的pH都在下降；一段时间后，柱内自上而下形成了pH6-9的梯度。pH6pH9pH9pH9起始一段时间后pH9柱中的pH变化：高梯度形成梯度下移梯度消失（低）pH6pH9pH6pH8pH6pH7pH6pH6最后，继续淋洗，pH梯度逐渐下移，直至底部流出液pH由9 降至6 并恒定于此值时，柱中的pH梯度随即消失。pH8pH72.蛋白质行为 蛋白质存在于“风云变幻”的层析柱中。（1）环境pH蛋白质pI时，蛋白质带正电荷，不与阴离子交换剂结合，以很快的速度向前移动；（2）当在某一距离时，环境pH蛋白质pI，蛋白质带负电荷，并与阴离子交换

4、剂结合；（3）随洗脱剂的流过，环境pH逐渐降低，再次低于pI，蛋白质带正电荷而被解吸，向下移动，上述过程反复进行。 蛋白质的pI不同，它们在被结合以前移动的距离是不同的，洗脱的顺序是按等电点排列的。3.聚焦效应指蛋白质在pH梯度环境中按其等电点进行排列的过程。 当一种蛋白质在柱中随洗脱液下移至其pI时，其将以缓慢的速度吸附、解吸附，直到pH小于pI时被析出。加样若是分批进行，只要是在第一份样没被洗出之前，再加第二份样，它会随洗脱的进行而追上第一份样中的同种蛋白，然后一同下移，最后被洗出。（连续的pH梯度为不同pI的蛋白质提供了一个避风港！）不同的蛋白质pI不同，聚焦的位置不同，故可以分开。用p

5、olybuffer多缓冲液洗脱的作用：（1）中和PBE，形成pH梯度；（上低下高）（2）使pH梯度下移；（3）冲洗柱体同时，推动蛋白质下移。受其影响蛋白质的行为有如下变化：（1）在pHpI区，带正电，不能进行离子交换，随流动相下移，速度急快；（2）在pHpI区，带负电，能够进行离子交换，被固定相吸附。（3）pH = pI区，不带电，不能进行离子交换，随流动相下移，速度缓慢；产生聚焦效应。 （相同pI蛋白聚集在避风港）！优点：有等电聚焦作用，分辨率高，又具柱层析的特点，操作简便。缺点：需用另一种方法除去样品中的多缓冲液，成本高。四、应用 分离pI在3-11范围的两性水溶性分子。 1.蛋白质； 2.多肽； 3.RNA.三、操作多缓冲剂的选择 根据被分离样的等电点大小、样品复杂程度等确定pH梯度范围。多缓冲剂的类型决定于pH梯度的下限。2. 多缓冲交换剂的选择与处理 根据pH梯度范围确定多缓冲交换剂与起始缓冲液。 起始缓冲液的pH要比pH梯度上限高约0.4个pH单位，以克服因起始缓冲液与洗脱液之间pH差值引起的pH波动。3. 样品的准备 加样量：通常每10ml床体积可以加100mg左右的样品样品浓度: 由于有聚焦效应，样品浓度可低些4. 加样和洗脱 洗脱液浓度和洗脱体积可参考表8-2 ，控制流速在30-40cm/h5