植物组织培养的一些注意事项

1、PAGE PAGE 19植物组织培养的一些注意事项一、常用培养基主要特性1、高盐成分培养基包括MS、LS、BL、BM、ER 等培养基。其中MS 培养基应用最广泛,其钾盐、铵盐及硝酸盐含量均较高, 微量元素种类齐全, 其养分数量及比例均比较合适, 广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。LS、BM、ER 培养基由MS 培养基演变而来。2 、硝硝酸钾含含量较高高的培养养基包括括B5 、N6 、LH、GS 等培养养基。B5 培养基基B5 培养基基除含有有较高的的钾盐外外, 还含含有较低低的铵态态氮和较较高的盐盐酸硫胺胺素, 较适合合南洋杉杉、葡萄萄及豆科科与十字字花科植植物等的的培养。N6

2、培养基基N6 培养基基( 朱至至清等119755 ) 系我国国学者创创造, 获国家家发明二二等奖, 适用用于单子子叶植物物花药培培养, 柑橘花花药培养养也适合合, 在楸楸树、针针叶树等等的组织织培养中中使用效效果也好好。SH 培养基基是矿盐盐浓度较较高的一一种培养养基, 其中铵铵与磷酸酸是由磷磷酸二氢氢铵( NHH4 HH2 PPO4 ) 提提供的, 这种种培养基基适合于于某些单单子叶及及双子叶叶植物的的培养。3 、中中等无机机盐含量量的培养养基H 培培养基本本培养基基大量元元素约为为MS 培养基基的一半半, 仅磷磷酸二氢氢钾及氯氯化钙稍稍低, 微量元元素种类类减少, 而含含量较MMS 为高高

3、, 维生生素种类类比MSS 多。适于花花药培养养。尼奇培培养基(Niootscch 119699 ) 此培养养基与HH 培养养基成分分基本相相同, 仅生物物素比HH 培养养基高110 倍倍。也适适合于花花药培养养。米勒培培养基(Milllerr 19963 ) 此此培养基基和Bllayddes(19666) 培养基基二者成成分完全全相同。适合大大豆愈伤伤组织培培养和花花药等培培养用。4 、低低无机盐盐培养基基大多情情况下用用于生根根培养基基。有以以下几种种:改良怀怀特培养养基(WWhitte 119633 )WS 培养基基(Woolteer & Skkoogg 19966)克诺普普液( Kno

4、op 119655 ) 花卉培培养上用用得多。贝尔什什劳特液液(Beerthheloot 119344)HB 培养基基( HHollley & BBakeer 119633) 此此培养基基在花卉卉脱毒培培养和木木本植物物的茎尖尖培养中中效果良良好。其其成分是是大量元元素比11/ 22 克诺诺普( Knoop ) 液稍稍多, 微量元元素用贝贝尔什劳劳特液, 每升升培养基基中加00 . 5mll。二、与培培养基有有关的一一些细节节问题1、培养养基所用用药品应应采用等等级较高高的化学学纯CPP(三级级) 及分分极纯AAR(二二级) , 以以免杂质质对培养养物造成成不利影影响。2、调节节PH也也可用精

5、精密pHH试纸(应在干干燥器中中保存, 以免免吸湿而而失效)。培养养基过酸酸的可用用1mool/ L 氢氢氧化钠钠( NNaOHH) 来来调节; 培养养基过碱碱的可用用1mool/ L 盐盐酸( HCll ) 来调节节( 11moll/ LL NaaOH 的配制制方法是是称400gNaaOH, 溶解解后加入入蒸馏水水, 定容容到1 0000ml 即可。1mool/ L HHCl 的配制制方法是是量取112mool/ LHCCl 884mll , 加水定定容至11 0000mll)。经经高压蒸蒸汽灭菌菌后, 由于某某些成分分的分解解(如蔗糖糖的分解解) 或氧氧化, 酸度会会增加( pHH 值一一

6、般可降降低0 . 22 )。有时玻玻璃器皿皿质量较较差, 其中一一部分物物质溶解解, 也会会影响酸酸度的变变化。这这些在调调整pHH 值时时都要考考虑进去去。分装装后应立立即灭菌菌, 若因因故不能能及时灭灭菌, 最好放放入冰箱箱中在224h 内完成成灭菌工工作。灭灭菌时压压力表读读数为00 . 8kgg/ ccm2 1 . 1kkg/ cm22 , 1211时保持持15mmin20mmin 即可。3、某些些生长调调节物质质, 如吲吲哚乙酸酸、玉米米素及某某些维生生素等物物质遇热热不稳定定, 因此此不能进进行高压压灭菌, 而需需用过滤滤方法灭灭菌, 经过过滤灭菌菌的溶液液, 可在在琼脂培培养基温

7、温度下降降到大约约40时加入入到已高高压灭菌菌的培养养基中。4、配好好的培养养基可放放到培养养室中预预培养33d ,若没有有污染反反应, 则证明明是可靠靠的, 可以使使用。暂暂时不用用的培养养基最好好置于110下保存存, 含有有生长调调节物质质的培养养基在445低温下下保存则则更理想想。含吲吲哚乙酸酸或赤霉霉素的培培养基应应在配制制一周内内用完, 其他他培养基基至多也也不能超超过一个个月。一一般情况况下, 两周内内应用完完, 以免免干燥变质。三、培养养材料及及消毒1、取材材季节的的影响：大多数数植物应应在其生生长开始始的季节节采样, 生长长末期或或已进入入休眠期期, 则外外植体对对诱导反反应迟

8、钝钝或无反反应。2、器官官的生理理状态和和发育年年龄：沿沿植物的的主轴, 越向向上的部部分所形形成的器器官其生生长的时时间越短短, 其生生理年龄龄也越老老, 越接接近发育育上的成成熟, 越易形形成花器器官。反反之, 越向下下, 其生生理年龄龄越小。木本植植物的组组织培养养中, 以幼龄龄树的春春梢嫩枝枝段或基基部的萌萌条较好好, 下胚胚轴与具具有3 对4 对真叶叶的嫩茎茎段, 生长效效果也较较好 。一般情情况下, 幼年年组织比比老年组组织具有有较高的的形态发发生能力力。3、材料料大小的的影响：材料越越小成活活率越低低, 茎尖尖培养存存活的临临界大小小应为一一个茎尖尖分生组组织带11 个2 个叶叶

9、原基, 约0 .2mmm0 .3mmm 大小小。叶片片、花瓣瓣等约为为5mmm2 , 茎段则则长约00 .55mm。因此, 除非非用于去去除病毒毒否则不不宜将外外植体切切的过小小。但并并不是说说外植体体越大越越好, 外植体体过大易易造成污污染, 有实验验证明外外植体越越大污染染率越高高。4、材料料的灭菌菌：一般般是组织织越大越越易污染染, 夏季季比冬季季带菌多多，甚至至不同年年份污染染的情况况也有区区别。取取材最好好选在中中午或下下午, 避开阴阴雨天取取材可减减少污染染率。消消毒是为为了消灭灭病菌, 以保保证无菌菌组织培培养的进进行。但但不同植植物及一一株植物物不同部部位的组组织, 其带菌菌程

10、度不不同, 它们对对不同种种类、不不同浓度度的消毒毒剂的敏敏感度也也不一样样。最初初所使用用的消毒毒剂种类类, 浓度度及消毒毒时间的的长短都都要进行行摸索, 以达达到最佳佳的消毒毒效果。材料有绒绒毛最好好在消毒毒液中加加入几滴滴吐温- 800 ,对对与难消消毒的根根及地下下部位材材料 可可将其浸浸入消毒毒液中进进行抽气气减压, 以帮帮助消毒毒液的渗渗入, 从而达到到彻底灭灭菌的目目的。潘潘学峰等等( 119988) 报报道, 12% 的双双氧水+ 0 .1%的升汞汞混合液液对南方方地下茎茎生姜灭灭菌100minn 的效效果最好好。四、材料料的接种种1、接种种室的消消毒：植植物组织织培养技技术实

11、际际上是一一种无菌菌操作和和无菌培培养技术术, 做好好接种室室的消毒毒是至关关重要的的。污染染的主要要来源是是空气中中的细菌菌和真菌菌孢子, 因此此, 每次次接种前前应进行行地面的的清洁卫卫生工作作, 并用用70%酒精喷喷雾使空空气的灰灰尘沉降降, 并用用紫外线线灯照射射20mmin。接种种前超净净工作台台面要用用新洁尔尔灭或酒酒精擦洗洗,并定期期清洗过过滤膜, 以延延长使用用寿命。2、无菌菌操作要要求：工工作人员员使用的的工作服服、帽子子、口罩罩等, 要经常常保持干干净, 并定期期进行消消毒, 即将洗洗净、晾晾干的衣衣帽、口口罩等用用纸包好好后与培培养基一一起进行行高压灭灭菌。工工作人员员的

12、头发发、衣服服、手指指中都带带有许多多杂菌, 为此此要穿上上工作服服, 戴上上帽子, 也必必须剪除除指甲, 并用用肥皂擦擦洗, 最好再再在新洁洁尔灭溶溶液中浸浸泡100min , 接接种操作作前则用用70%酒精擦擦洗。工工作人员员的呼吸吸所产生生的污染染, 主要要是在接种时时谈话或或咳嗽所所引起的的, 因此此, 在操操作时应应禁止谈谈话并应应戴上口口罩。3、材料料的分离离、切取和和接种切割动作作要快, 防止止挤压使使材料受受损伤而而招致培培养失败败, 也要要避免使使用生锈锈的刀片片, 以防防止氧化化现象产产生。接接种时要要防止交交叉污染染的发生生,刀和镊镊子等接接种工具具使用一一次应放放入70

13、0% ( 或95%)酒精精中浸泡泡, 然后后灼烧放放凉备用用。接种时轻轻轻取下下封口纸纸, 动作作要慢以以免气流流冲入瓶瓶中造成成污染。将瓶口口靠近酒酒精灯火火焰, 瓶口倾倾斜, 以免空空气中的的微生物物落入瓶瓶中,将瓶口口外部在在灯焰上上燎数秒秒钟, 将灰尘尘杂物等等固定在在原处, 然后后用镊子子将外植植体送入入瓶中, 材料料在培养养容器内内的分布布要均匀匀, 以保保证必要要的营养养面积和和光照条条件。茎茎尖、茎茎段等基基部插入入固体培培养基中中, 叶片片通常将将叶背接接触培养养基, 这是由由于叶背背气孔多多, 利于于吸收水水分和养养分的缘缘故。五、材料料的初代代培养1、实验验方案的的设计1

14、）、单单因子实实验设计计：单因因子实验验是组织织培养中中最常用用的实验验方法, 尤其其在选择择适当的的激素种种类和浓浓度配比比上使用用最多。2 ）、正交实实验设计计植物离离体培养养的成功功是由多多种因素素决定的的。正交交设计是是多因素素分析的的有力工工具, 它可以以很方便便的从众众多因素素中选出出主要影影响因素素及最佳佳水平, 因为为它可以以用较少少的实验验次数得得到较多多的信息息。例如如, 一个个7 因素素水平的的实验, 若将将各因素素水平全全部组合合都做一一遍, 需要27 = 1288 次, 而正正交设计计只需做做8 次实实验就可可以了, 虽然然实验次次数减少少了, 但因为为各因素素水平搭

15、搭配均匀匀, 88 次实实验基本本代表了了全部实实验的情情况。正交实验验的设计计, 主要要工具是是正交表表。大多多数生物物统计学学书都列列出了可可供选择择的正交交表,如L4 ( 23 ) , LL8 (227 )见(表2 - 111 , 表2 - 122) 。字母LL 右下下角号码码8 表示示它有88 个实实验要做做, 括号号内的指指数7 表示这这张表所所安排的的实验最最多可考考察7 个因素素(也可安安排2 个6 个, 超过过7 个要要选择其其他正交交表) , 底底数2 表示被被考察的的因素只只要求两两个水平平。在进进行实验验前可根根据要测测试因素素的多少少及每种种因素所所考察的的水平, 选择

16、择适合的的正交表表, 然后后按表进进行实验验。现举举一个例例子来说说明, 设影响响某种植植物试管管苗生长长的因素素有光照照时间、光照强强度、ppH 值值、温度度、蔗糖糖浓度、BA浓度度、NAAA 浓浓度7 个因素素, 每个个因素选选择两个个水平, 即, 光照照时间( 100h , 144h )、光照照强度(10000lxx , 20000lxx )、pH 值( 55 . 5 , 5 . 88 )、温度( 200, 225) 、BA 浓度( 0 . 5 , 22 . 0 )、NAAA 浓度度( 00 . 5 ,1 . 0)、蔗糖糖浓度(2% , 44%)。现根据据因素和和水平的的多少选选择一个个

17、适合本本实验的的正交表表, 选L8 (227)最理想想, 填表表时, 因素水水平对号号入座, 见表表( 22 - 13 )。第第一号实实验是光光照时间间10hh/ dd、光照照强度110000lx、pH 值5 . 5、BA 浓度2 . 00、NAAA 浓度度0 . 5、蔗糖浓浓度4% , 其他实实验依次次类推。根据88 个实实验结果果, 如出出苗数量量、苗高高、生根根数、移移栽成活活率等, 综合合考虑, 根据据需要选选取各最最适培养养条件。也可通通过一定定的计算算方法(参考统统计学书书) , 算出出极差( R) , 极差(RR) 表表示每个个因素在在实验中中所起作作用的大大小, R 越越大表示

18、示该因素素的不同同水平对对实验结结果的影影响越大大, 但若若没有可可计算的的指标时时, 还是是选择单单因子实实验较好好。初代培养养物的建建立1）、保保证无菌菌2）、条条件合适适：首先先, 一一定要选选择好合合适的作作物种类类、品种种及培养养的部位位; 其其次,一一定要选选择合适适的培养养基, 激素及及其他添添加物; 还要要注意掌掌握适宜宜的环境境条件。所以在在进行一一种植物物的组织织培养之之前, 应查找找该种植植物有关关方面的的资料, 根据据这种植植物过去去所采用用的培养养部位、培养基基、培养养条件和和培养技技术等, 再决决定自己己的工作作步骤。3）、操操作技术术过关3、污染染的防治治1）、植

19、植物材料料的选择择及防止止污染通常多年年生的木木本材料料比一二二年生的的草本材材料带菌菌多; 老的材材料比幼幼嫩的材材料带菌菌多; 田间生生长的材材料比温温室生长长的材料料带菌多多; 带带泥土的的材料比比不带泥泥土的材材料带菌菌多。为为此对于于培养材材料的取取材就应应很认真真地加以以选择, 以减减少污染染的发生生。用茎尖作作外植体体时, 应在室室内或无无菌条件件下对枝枝条进行行预培养养。将枝枝条用水水冲洗干干净后插插入无糖糖的营养养液或自自来水中中, 使使其发枝枝, 然然后以这这种新抽抽的嫩枝枝条作为为外植体体, 便便可大大大减少材材料的污污染。或或在无菌菌条件下下对采自自田间的的枝条进进行暗

20、培培养, 待抽出出徒长的的黄化枝枝条时取取材, 也可明明显地减减少污染染。对木本植植物等难难以消毒毒的材料料可采用用多次灭灭菌法。如将切切好的外外植体放放入1 . 33%次氯氯酸盐溶溶液中(商品漂漂白粉225%的的溶液)消毒330miin , 然后后用无菌菌水冲洗洗3 次次, 再再放在无无菌条件件下,次次日用22 . 6%次次氯酸钠钠灭菌330miin , 然后后用无菌菌水冲洗洗3 次次。也可可采用多多种药液液多次浸浸泡法,以加强强灭菌效效果。材料内部部易感染染病菌, 在这这种情况况下, 必须在在培养基基中加入入抗生素素类, 防止初初代培养养物污染染。、人为污污染的防防止接种前应应用肥皂皂将手

21、仔仔细洗净净后, 再用770%酒酒精擦洗洗双手, 并需需及时剪剪除指甲甲。在工工作中特特别要注注意避免免交叉感感染, 双手必必须清洁洁, 工工具则用用一次即即需消毒毒一次。工作人人员呼吸吸所产生生的污染染, 主主要是接接种时说说话或咳咳嗽所引引起的, 因此此, 操操作时严严禁谈话话, 并并应戴上上口罩, 也应应穿工作作服, 戴工作作帽。污染中特特别注意意一种呈呈乳白色色的细菌菌污染, 这种种细胞为为芽孢杆杆菌。法法国林木木育种协协会鉴定定为迟缓缓芽孢杆杆菌( Baccilllus lennluss) , 它外外被荚膜膜, 耐耐高温, 一般般消毒剂剂难以杀杀死。它它可随培培养材料料、用具具等传播

22、播; 它它可出现现在培养养基表面面, 或或呈滴形形云雾状状存在于于培养基基内。若若出现应应严格灭灭菌, 清洗用用具, 更换消消毒酒精精。4、防止止外植体体褐变1）、褐褐变的影影响因素素褐变是由由于组织织中的多多酚氧化化酶被激激活, 使细胞胞的代谢谢发生变变化, 酚类物物质被氧氧化后产产生醌类类物质, 这类类物质呈呈棕褐色色, 它它们会逐逐渐扩散散到培养养基中, 抑制制其他酶酶的活性性, 毒毒害培养养的材料料。褐变变的影响响因素是是复杂的的, 随随植物种种类、基基因型、外植体体的部位位及生理理状况等等的不同同而危害害的程度度也有区区别。材料本身身的生理理状态不不同, 接种后后褐变的的程度也也不同

23、。如在欧欧洲栗的的培养中中, 用用幼年型型的材料料培养含含醌类物物质少, 而用用成年型型材料培培养时含含醌类物物质多。而在卡卡德利亚亚兰的培培养中, 较短短的新生生茎致褐褐物质含含量高, 而较较长的新新生茎致致褐物质质含量低低, 另另外致褐褐物质的的含量也也因季节节的不同同而不同同, 冬冬季褐变变少, 夏秋季季褐变最最严重, 存活活率最低低。在枝枝条上取取芽的时时期及所所取部位位不同也也有区别别, 如如欧洲栗栗取1 月后半半月的芽芽培养则则醌的形形成少, 而在在5 月月6 月取芽芽培养则则醌类物物质发生生严重。在第一一至第四四个芽的的生长期期单宁类类物质合合成多, 因此此, 接接种后褐褐变也严

24、严重。油油棕用幼幼嫩外植植体( 如胚)培养较较少褐变变, 而而用高度度分化的的叶片接接种后则则容易褐褐变。总总之, 分生部部位接种种后形成成的醌类类物质少少, 而而分化的的部位则则形成的的醌类物物质较多多。培养基成成分过高高的无机机盐浓度度会引起起棕榈科科植物外外植体酚酚的氧化化。例如如油棕用用MS无无机盐培培养基容容易引起起外植体体的褐变变, 而而用降低低了无机机盐浓度度的改良良MS 培养基基时则可可减轻褐褐变, 而且可可获得愈愈伤组织织和胚状状体。激激素使用用不当时时, 材材料也容容易褐变变。细胞胞分裂素素6 - 苄基基氨基嘌嘌呤或激激动素有有刺激多多酚氧化化酶活性性提高的的作用, 这在在

25、甘蔗的的组织培培养中表表现十分分明显。在外植植体最适适宜的脱脱分化条条件下, 分生生能力强强的细胞胞大量增增殖, 酚类的的氧化会会受到抑抑制。在在芽旺盛盛增殖时时, 褐褐变也被被抑制。此外, 培养养条件不不适宜, 如温温度过高高或光照照过强, 均可可使多酚酚氧化酶酶的活性性提高, 从而而加速被被培养组组织的褐褐变。培养时间间过长接接种后材材料培养养时间过过长, 未及时时转移, 也会会引起材材料的褐褐变, 甚至导导致全部部死亡, 这在在培养过过程中是是经常可可见的。、褐变的的防止选择适当当的外植植体和培培养条件件： 选选择适当当的外植植体和培培养条件件是克服服褐变的的最主要要的手段段。外植植体应

26、有有较强的的分生能能力, 在最适适宜的细细胞脱分分化和再再分化的的培养条条件下, 使外外植体处处于旺盛盛的生长长状态, 便可可大大减减轻褐变变。抗氧化剂剂的作用用：在培培养基中中加入抗抗坏血酸酸、聚乙乙烯吡咯咯烷酮( PVVP)、半胱氨氨酸等抗抗氧化剂剂, 或或用抗氧氧化剂进进行材料料的预处处理或预预培养, 可减减轻醌类类物质的的毒害。连续转移移：对于于易褐变变的材料料, 进进行连续续转移, 可以以减轻醌醌类物质质对培养养物的毒毒害作用用。试管苗的的增殖与与继代培培养（一）、加快试试管苗的的繁殖速速度1、试管管苗繁殖殖类型试管繁殖殖类型共共有五种种：微型型扦插型型、丛生生芽增殖殖型、器器官发生

27、生型、胚胚状体发发生型、原球茎茎发生型型，一定定要注意意其遗传传稳定性性, 前前三种途途径一般般能保持持遗传稳稳定性。2、试管管繁殖速速率及计计算统计试管管苗增殖殖速度, 有以以苗为单单位, 也有以以芽或未未生根的的小茎作作单位的的, 以以原球茎茎球状体体或胚状状体因难难以统计计, 则则以瓶为为单位。大多数数以芽和和苗作单单位。试管苗理理论上一一年能繁繁殖多少少, 可可用下面面的简单单公式计计算:Y = mXnnY = 年繁殖殖数m = 无菌母母株苗数数X = 每个培培养周期期增殖的的倍数n = 全年可可增殖的的周期次次数例如月季季每5 周转接接一次, 甲品品种每次次增殖33 倍, 乙品品种每

28、次次增殖55 倍, 丙品品种每次次增殖77 倍, 假定定一开始始都是一一个芽, 那么么这三个个品种一一年能繁繁殖多少少呢? 根据公公式可知知:n =3365dd/355d= 10 .4 , 即即每年可可转接110 次次, 那那么这三三个品种种年繁殖殖率分别别计算如如下:甲品种YY = 131 0 = 599 0000 = 5 .91044乙品种YY = 151 0 = 9 7600 0000 = 9 .7661066丙品种YY = 171 0 = 2882 0000 0000 = 2 .821088从上可知知甲品种种每5 周转接接一次, 一年年可繁殖殖出5 万多苗苗, 乙乙品种每每周期增增殖5

29、 倍, 一年可可得9000 多多万苗, 而丙丙品种每每周期增增殖7 倍, 一年可可繁殖出出2 亿亿苗来。不过实际际值远比比理论值值为低。因为实实践中要要受到多多种因素素制约, 困难难很多。但理论论计算可可以作为为一个计计算产量量的指标标, 提提供参考考, 有有它的积积极意义义。3、提高高繁殖速速度的方方法不仅试管管苗的繁繁殖类型型不同, 而且且在试管管内又受受到基因因型、外外植体来来源、年年龄、部部位、培培养基种种类、附附加成分分和培养养环境等等多种因因素的影影响, 应通过过具体试试验来摸摸索每种种植物最最快最好好的繁殖殖方法。1）、改改进培养养基：、不同的的植物材材料需要要使用不不同类型型的

30、培养养基。、糖具有有维持培培养基渗渗透压的的作用，在培养养过程中中植物组组织不断断地从培培养基中中吸收糖糖，糖浓浓度降低低，当糖糖浓度不不能维持持正常渗渗透压时时，材料料要转移移到新鲜鲜培养基基。培养养基中的的维生素素绝大部部分为BB族维生生素，它它们一各各种辅酶酶的形式式参与植植物代谢谢活动，影响形形态发生生、分化化及试管管苗的生生长，为为防植物物缺乏，一般均均加入。、植物生生长调节节物质在在试管苗苗增殖中中期决定定性作用用促进叶芽芽形成和和生长的的激素：细胞分分裂素抑抑制了植植物的顶顶端优势势，使得得叶芽不不断分化化和生长长，逐渐渐形成芽芽丛，并并促进芽芽丛生长长。大多多植物最最适用量量为

31、1.02.00，一般般用量00.110.0。应应用最多多的是66-BAA,其次次KT和和2ipp，ZTT用的较较少，因因它的价价格太贵贵。对于于微型扦扦插型繁繁殖可不不加细胞胞分裂素素或加00.1以以下也可可。除了了细胞分分裂素以以外，还还可加入入低浓度度的生长长素，以以促进叶叶芽的生生长，但但要防止止愈伤组组织化。常用的的有NAAA,IIBA,IAAA，浓度度在0.11.00。在实际操操作中高高浓度细细胞分裂裂素和低低浓度生生长素的的配比，既能提提高腋芽芽的增殖殖速度，也能保保证腋芽芽健壮生生长。如如果细胞胞分裂素素浓度过过高生长长素浓度度过低，会形成成过于细细密的嫩嫩芽，虽虽然提高高了增殖

32、殖速度，但苗多多而弱，降低了了芽的质质量。但但如果细细胞分裂裂素过低低，生长长素过高高，影响响芽的增增殖速度度，甚至至有时没没有侧芽芽产生。B、诱导导不定芽芽形成和和生长的的激素：除现有有的芽之之外, 任何器器官上的的, 通通过器官官发生重重新形成成的芽称称为不定定芽。促促进外植植体形成成不定芽芽, 要要使用一一定量的的细胞分分裂素和和生长素素, 一一般浓度度不能过过高。否否则不但但使器官官分化能能力降低低, 而而且也使使遗传性性难以稳稳定。诱导外植植体形成成不定芽芽时, 一般使使用细胞胞分裂素素的浓度度高于生生长素浓浓度的配配比, 但也经经常采用用细胞分分裂素和和生长素素浓度的的比值接接近于

33、11 的配配比。C、促进进胚状体体的形成成和繁殖殖的激素素：胚状状体途径径的优点点是增殖殖率高, 而且且同时具具有胚根根和胚芽芽, 可可免去生生根。现现在胚状状体发生生还不普普遍或产产生的胚胚状体难难以成株株或成株株率太低低, 以以及遗传传性尚不不稳定, 故仅仅在有限限植物中中应用。一般是是在含有有丰富还还原氮的的培养基基上, 加有生生长素, 特别别是2 , 44 - D 以以诱导胚胚状体的的发生, 然后后转移到到降低浓浓度或没没有生长长素的培培养基上上使其成成熟、萌萌发和生生长。培养基中中, 还还可加入入其他附附加成分分, 如如氨基酸酸、水解解乳蛋白白( LLH ) 3000mgg/ LL5

34、000mgg/ LL、水解解酪蛋白白(CHH) 2200mmg/ L5500mmg/ L, 以及腺腺嘌呤(ADEE) 11mg/ L80mmg/ L 等等, 以以促进试试管苗的的生长。、改善培培养条件件:试管管苗增殖殖与培养养条件如如温度、光照、湿度、培养器器皿和培培养基的的pH值值密切相相关, 需要进进行控制制, 以以促进繁繁殖。保持试管管苗的继继代培养养试管苗的的继代方方法、液体培培养、固体培培养影响试管管苗继代代培养的的因素及及解决措措施、驯化现现象：有有些植物物在开始始的继代代培养中中需要添添加生长长调节物物质, 其后加加入少量量或不必必加入生生长调节节物质就就可以生生长, 此现象象就

35、叫做做“ 驯化化”。、在长期期的继代代培养中中, 材材料自身身内部要要发生一一系列的的生理变变化, 除了前前面讲的的“ 驯化化”现象外外, 还还会出现现形态发发生能力力的丧失失。一般认为为分化能能力衰退退主要有有三个因因素:愈伤组织织中含有有从外植植体启动动分裂时时就包括括进来的的成器官官中心（分生组组织），当重复复继代则则会逐渐渐减少或或丧失，这意味味着不能能形成维维管束，只能保保持无组组织的细细胞团。形态发生生能力的的减弱和和丧失也也可能与与内源生生长物质质的减少少或丧失失有关。也可能是是细胞染染色体出出现畸变变，数目目增加或或丢失。影响继代代培养的的其他因因素、植物材材料的影影响 不同种

36、种类植物物，同种种植物不不同品种种，同一一植物不不同器官官或不同同部位继继代繁殖殖能力也也不相同同。一般般是草本本木本本；被子子植物裸子植植物；年年幼植物物老年年植物；刚分离离植物已继代代植物；胚营营养体植植物；芽芽胚状状体愈愈伤组织织。、培养基基及培养养条件 培养养基及培培养条件件适当与与否对能能否继代代培养影影响颇大大，故常常改变培培养基和和培养条条件来保保持继代代培养。、继代培培养时间间长短 关于于继代培培养次数数对繁殖殖率的影影响的报报道不一一。有的的材料长长期继代代可保持持原来的的再生能能力；有有的经过过一定时时间继代代后才有有分化再再生能力力；而有有的随继继代时间间加长而而分化再再

37、生能力力降低。、季节的的影响 植物物材料能能否继代代与季节节有关。一般能达达到每月月继代3310倍倍，即可可用于大大量繁殖殖，盲目目追求过过高增殖殖倍数一一是所产产小苗小小而弱，给生根根、移栽栽带来很很大困难难，二是是会引起起遗传性性不稳定定，造成成灾难性性后果。试管苗的的生根与与移栽试管苗的的生根试管内生生根、根发生生过程 植物物离体培培养根的的发生都都来自不不定根。根的形形成从形形成上可可以分为为两个阶阶段，即即形成根根源基和和根源基基的伸长长及生长长。前一一阶段根根源基的的形成包包括第一一次、第第二次细细胞横分分裂和第第三次细细胞纵分分裂，细细胞横分分裂能够够被生长长素促进进。根源源基的

38、启启动和形形成约历历时488h，后后一阶段段为细胞胞快速伸伸长阶段段，大约约需24448hh。根源源基的形形成和生生长素有有关，根根源基的的伸长可可以在没没有外源源生长素素下实现现。、影响试试管内生生根的因因素 、植物材材料 不同植植物、不不同基因因型、同同一植株株不同部部位和不不同年龄龄对分化化根都有有决定性性因素。若试管管里不生生根不要要完全从从培养中中去找原原因，也也应在取取材时考考虑。不不同植物物的一般般生根规规律是：木本比比草本难难，成年年树比幼幼年树难难，乔木木比灌木木难。、基本培培养基 大多多数使用用低浓度度的MSS培养基基，其中中不少使使用1/2MSS或1/3MSS培养基基。大

39、量量元素中中有人认认为NHH4+多可能能不利于于发根，生根需需要P和K元素，但不宜宜太多；而Caa2+多数数报道有有利于根根的形成成于生长长。微量量元素对对生根有有利的是是B和Fe。生生根通常常用1%3%的的蔗糖。植物生长长调节剂剂 据据报道单单用一种种生长素素的占551.5%，生长素素加激动动素占220.11%。aa、愈伤伤组织分分化根时时使用NNAA最最多，浓浓度以11.02.00为多。使用IIAA+激动素素浓度范范围以11.04.00和0.010.002居多多。b、而胚轴轴、茎段段、插枝枝、花梗梗等分化化根时，使用IIBA居居首位，浓度以以1.001为多多。可见见生根培培养多数数使用生生

40、长素，大多以以IAAA、IBBA、NNAA单单独用或或配合使使用，或或与低浓浓度激动动素配合合使用。NAAA与细胞胞分裂素素配合时时摩尔比比在（22030）：1为为好。一一般赤霉霉素、细细胞分裂裂素、乙乙烯通常常不利于于发根，如与生生长素配配合，一一般浓度度宜低于于生长素素，ABBA可能能有助于于发根，植物生生长延缓缓剂多效效唑（MMET）对不定定根的形形成也有有良好作作用，使使用浓度度0.114.00。、使用方方法 将生根根材料先先在一定定浓度植植物生长长调节剂剂中浸泡泡或培养养一段时时间，然然后转入入无植物物生长调调节剂培培养基中中培养，能显著著提高生生根率。、其他物物质 间苯三三酚、脯脯

41、氨酸、核黄素素、活性性炭等等等。、继代培培养 新梢生生根能力力随继代代时间增增长而能能力增加加，植物物在培养养初期不不易生根根。从试试管苗长长成的植植株上去去枝条比比在一般般植株上上取的更更易生根根。、光照强强度和光光照时间间对生根根的影响响十分复复杂，结结果不一一。、pH值值 一一般在55.06.00。、温度 166C 25C。试管外生生根有些植物物种类在在试管内内难以生生根，或或有根但但与茎维维管束不不相通，或根与与茎联系系差，或或有根无无根毛，或吸收收功能极极弱不易易成活，此时可可采用试试管外生生根的方方法，把把生根和和驯化过过程联系系起来，即可大大幅度降降低成本本，又可可提高移移栽成活活率。试试管外生生根有三三种方法法：、在试管管内诱导导根源基基再移栽栽 、在生根根小室进进行生根根和炼苗苗 做做一个生生根小室室，不用用琼脂和和蔗糖，而用透透气又保保湿的基基质如泥泥炭、蛭蛭石、珍珍珠岩、苔藓等等，并要要控制温温度、光光照、采采用人工工喷雾，雾滴要要细。、盆插和和瓶插生生根法 用罐罐头瓶或或盆内装装有泥炭炭或腐殖殖土与细细沙，每每瓶插入入20株株或300株无根根苗，插插入深度度为0.31.22cm,加入11/22MS+1.005.00IBAA或IAAA生根根液,，在一定定温度、