蛋白质整体功能的在体遗传操作新技术 标书

1、PAGE PAGE 14项目名称称：蛋白质整整体功能能的在体体遗传操操作新技技术新方方法研究究首席科学学家：吴强 上上海交通通大学起止年限限：20099.1至至20113.88依托部门门：中国科学学院一、研究究内容生物活体体是生命命活动体体现的物物质基础础，也是是最复杂杂最重要要的研究究蛋白质质功能的的对象。遗传操操作是研研究蛋白白质活体体功能最最重要的的方法之之一。220077年诺贝贝尔奖授授予的小小鼠反向向遗传学学基因打打靶技术术有力地地推动了了蛋白在在体功能能研究。由于生生命体经经过亘古古的进化化选择，蛋白质质家族在在活体系系统中形形成了复复杂的功功能冗余余性和表表达协同同性。由由于正向

2、向遗传学学突变和和筛选的的局限性性，反向向遗传学学在研究究蛋白质质在体功功能发挥挥着越来来越重要要的作用用。在小小鼠和果果蝇模式式生物中中，基因因打靶技技术相继继产生，有力地地推动了了生命科科学的研研究，但但是现有有基因打打靶技术术主要是是单位点点基因敲敲除，耗耗时费力力而且效效率还有有待提高高。本项项目的总总体设想想是：以以开发快快速基因因打靶方方法为主主线，以以研究重重要蛋白白家族整整体在体体功能为为核心目目标，以以小鼠和和果蝇为为脊椎动动物和无无脊椎动动物的代代表性模模式生物物，拟开开发出高高效实用用的在体体DNAA大片段段打靶新新技术新新方法，为蛋白白质整体体在体功功能的研研究提供供高

3、起点点的技术术平台，有力推推动国家家中长期期蛋白质质研究重重大科学学研究计计划向前前发展。本项目拟拟解决的的关键科科学问题题是：开开发快速速基因打打靶和在在体DNNA大片片段基因因打靶新新技术新新方法，推动我我国小鼠鼠和果蝇蝇模式生生物反向向遗传学学的发展展，为国国家蛋白白质研究究重大科科学研究究计划提提供强有有力的技技术支撑撑体系。重点选选择神经经系统，表观遗遗传，以以及肿瘤瘤抗原等等方面的的重要功功能蛋白白质家簇簇进行新新技术新新方法开开发研究究。例如如，我们们选取了了神经系系统原钙钙粘蛋白白和嗅觉觉受体蛋蛋白质家家族进行行在体DDNA大大片段定定向敲除除的开发发研究，这些蛋蛋白质家家族在

4、脑脑发育和和脑认知知、神经经连接复复杂性和和特异性性、以及及小鼠行行为中具具有重大大科学意意义，但但其在体体的整体体功能研研究又是是瓶颈问问题，我我们试图图在了解解神经系系统重要要蛋白家家族在体体功能的的基础上上，认识识神经系系统的复复杂性，可靠性性以及其其高度可可塑性，为建立立人类精精神疾病病的小鼠鼠模型提提供实验验基础和和技术平平台，为为将来治治疗人类类神经系系统疾病病提供有有用实验验依据。神经系统统是最复复杂的生生命系统统，在与与环境的的相互作作用过程程中具有有高度适适应性，同时神神经系统统在发育育和脑认认知过程程中也具具有高度度可塑性性。表观观遗传和和肿瘤发发生也是是生命科科学研究究的

5、重大大问题。我们所所选取的的主要研研究目标标是具有有良好工工作基础础和重大大科学意意义，经经过努力力可以实实现功能能研究重重大突破破的蛋白白质家簇簇。本项项目将以以小鼠和和果蝇为为模式生生物，以以神经系系统重要要细胞粘粘附和信信号传导导膜蛋白白、表观观遗传组组蛋白和和黑色素素肿瘤抗原原蛋白家家族在体体研究为为模式蛋蛋白质家家族，来来开发DDNA大大片段定定向敲除除新技术术新方法法。编码码这些蛋蛋白质家家族的基基因通常常是复杂杂的基因因族，往往往形成成巨大的的串联阵阵列，同同时这些些基因又又具有高高度相似似性，其其所编码码的蛋白白家族在在漫长的的进化过过程中形形成功能能重复性性和冗余余性，因因此

6、蛋白白质家族族整体功功能的在在体功能能研究具具有重大大挑战性性。以基因打打靶研究究蛋白质质在活体体系统中中的功能能是国际际上生命命科学和和生物技技术的热热点，小小鼠和果果蝇基因因打靶技技术是蛋蛋白质在在体功能能研究最最尖端技技术之一一。本项项目的主主要研究究内容是是：以犹犹他大学学Marrio Cappeccchi教教授的小小鼠基因因打靶技技术和KKentt Goolicc教授的的果蝇基基因打靶靶技术为为基础，提高单单位点基基因打靶靶的效率率，试图图了解基基因打靶靶在脊椎椎动物和和无脊椎椎动物中中的一般般规律，为勾勒勒模式生生物基因因打靶全全景图提提供科学学依据，并深入入分析高高效DNNA大片

7、片段定向向敲除的的条件，建立在在体DNNA大片片段定向向敲除新新技术新新方法，为蛋白白质研究究重大科科学研究究计划提提供强有有力的模模式生物物反向遗遗传学技技术平台台基础。二、预期期目标总体目标标：整合我我国目前前蛋白质质在体功功能研究究反向遗遗传学领领域的部部分优势势力量，综合利利用国家家蛋白质质功能研研究的成成果积累累，结合合国际尖尖端小鼠鼠和果蝇蝇基因打打靶技术术，力争争在DNNA大片片段定向向打靶新新技术新新方法方方面取得得重大突突破，为为我国蛋蛋白质研研究重大大科学研研究计划划提供国国际领先先的技术术平台体体系。重重点选择择在复杂杂神经系系统细胞胞连接和和信号传传导，表表观遗传传和肿

8、瘤瘤疾病等等方面具具有重大大科学意意义，经经过努力力有望取取得功能能研究重重大突破破的蛋白白质家族族，对其其整体的的在体功功能进行行深入系系统的研研究，为为阐明神神经系统统的复杂杂性和可可塑性、表观遗遗传和肿肿瘤发生生机理提提供理论论依据，为将来来治疗人人类疾病病提供有有用的实实验数据据。本项项目以开开展蛋白白质在体体功能国国际前沿沿研究为为目标，总体上上力争开开发出小小鼠和果果蝇高效效实用的的DNAA大片段段定向打打靶新技技术新方方法，整整体上达达到国际际先进水水平并在在某些技技术领域域处于国国际领先先地位，在蛋白白质在体体研究的的国际前前沿占有有一席之之地，开开创我国国利用反反向遗传传学进

9、行行蛋白质质功能研研究的新新局面。项目五年年预期目目标：在技术术方面，力求开开发高效效的在体体DNAA大片段段定向打打靶新技技术新方方法，突突破目前前体外方方法的技技术瓶颈颈和局限限。同时时努力提提高现有有单位点点基因打打靶方法法技术的的效率，以大大大缩短基基因打靶靶的周期期；在理理论方面面，探讨讨小鼠和和果蝇DDNA大大片段定定向打靶靶的基本本规律；在人才才培养方方面，培培养出更更多的具具有蛋白白质组学学、基因因组学、遗传学学、神经经生物学学、肿瘤瘤生物学学和分子子生物学学等多学学科背景景，谙熟熟蛋白质质在体功功能研究究遗传操操作新技技术新方方法，具具有很强强原创能能力的高高级科学学研究人人

10、才。总总之，通通过开发发在体DDNA大大片段定定向敲除除新技术术新方法法，使我我国在研研究蛋白白质家族族在生物物活体中中整体功功能的遗遗传操作作技术达达到国际际领先水水平，进进一步提提升我国国在蛋白白质研究究领域的的国际地地位。在国际一一流学术术期刊上上发表一一系列较较高水平平的原创创论文，并获得得较多的的引用，在小鼠鼠和果蝇蝇蛋白质质在体功功能研究究领域占占有一席席之地，在国际际上取得得较大影影响。培培养一批批富有原原创能力力且具有有一定国国际影响响力的中中青年科科学家和和学术带带头人，为我国国蛋白质质整体功功能的在在体研究究提供DDNA大大片段定定向敲除除新技术术新方法法，为蛋蛋白质研研究

11、国家家重大科科学研究究计划的的进一步步发展奠奠定坚实实的技术术和人才才基础。三、研究究方案实现本项项目预期期目标的的总体研研究思路路是：以以小鼠和和果蝇为为模式生生物，以以开发高高效实用用的在体体DNAA大片段段定向敲敲除新技技术新方方法为中中心，利利用常规规的基因因打靶技技术定向向定点地地把looxP或或FRTT位点分分别敲入入到两个个同源染染色体目目的基因因簇的起起始处和终止止处，获获取两个个不同的的小鼠或或果蝇品品系，通通过此两两个品系系的交配配获得复复合杂合合子，然然后在CCre或或Flpp位点特特异性重重组酶的的催化下获获取基于于Cree-looxP或或Flpp-FRRT的跨跨等位基

12、基因重组组，从而而得到DDNA大大片段定定向敲除除动物品品系。本项目研研究的技技术路线线是：整合现现有分子子生物学学和分子子遗传学学等蛋白白质研究究的技术术方法，以常规规基因打打靶技术术为基础础，采用用Cree-looxP和和Flpp-FRRT位点点特异性性重组系系统，通通过在生生物活体体中同源源染色体体位点特特异性的的重组，开发研研究蛋白白质家族族整体功功能的在在体DNNA大片片段定向向敲除新新技术新新方法。我们将将在小鼠鼠和果蝇蝇模式生生物中分分别验证证Cree-looxP和和Flpp-FRRT重组组系统，通过对对比Crre-lloxPP和Fllp-FFRT系系统在小小鼠和果果蝇模式式生物

13、中中的效率率，探讨讨在体DDNA大大片段定定向敲除除新技术术新方法法的基本本规律。在小鼠模模式生物物中，我我们将利利用Caapeccchii的常规规基因打打靶技术术，把lloxPP位点打打靶到目目的基因因簇的起始处处，建立立一个目目的基因因簇起始始处包含含loxxP位点点的小鼠鼠品系。同时，我们也也利用同同样的基基因打靶靶技术，把looxP位位点打靶靶到目的的基因簇簇的终止处处，建立立目的基基因簇终终止处包包含looxP位位点的另另一个小小鼠品系系。然后后，通过过交配这这两个不不同的小小鼠品系系获得同同源染色色体目的的基因簇簇的起始始和终止止处具有有两个不不同的lloxPP位点的的复合杂杂合子

14、小小鼠。这这两个lloxPP位点必必需具有有相同的的方向性性，才能能保证位位于两个个loxxP位点点之间的的DNAA大片段段可以在在Cree重组酶酶的催化化下被定定向地敲敲除。同同时设计计Hprrt-CCre小小鼠交配配方案提提供Crre重组组酶。这这样就可可以通过过在体CCre-loxxP跨等等位基因因重组获获得目的的基因簇簇的整体体定向敲敲除。在果蝇模模式生物物中，我我们将利利用犹他他大学GGoliic教授授开发的的常规果果蝇基因因打靶方方法，把把FRTT位点打打靶到目目的基因因簇的起始处处，建立立一个目目的基因因簇起始始处包含含FRTT位点的的果蝇品品系。同同时，我我们也利利用同样样的基

15、因因打靶技技术，把把FRTT位点打打靶到目目的基因因簇的终止处处，建立立另一个个目的基基因簇终终止处包包含FRRT位点点的果蝇蝇品系。这样就就可以通通过在体体Flpp-FRRT的重重组系统统获得目目的基因因簇在果果蝇中的的整体定定向敲除除。可行性：国际上上遗传操操作的迅迅速发展展预示着着DNAA大片段段定向敲敲除即将将取得突突破，小小鼠和果果蝇DNNA操作作的最新新成果指指明了蛋蛋白质家家族整体体功能研研究的发发展趋势势。在果果蝇模式式生物中中，利用用转座子子可以随随机地在在基因组组中插入入FRTT位点。当同源源染色体体上的两两个转座座子分别别含有一一个方向向相同的的FRTT位点时时，在FFl

16、p重重组酶的的作用下下便可产产生DNNA大片片段敲除除，遗憾憾的是这这些DNNA大片片段的缺缺失断点点仍然是是随机的的，因此此现有的的果蝇DDNA大大片段敲敲除方法法不具有有靶向性性。在小小鼠模式式生物中中，通过过两次体体外操作作可以产产生ESS细胞的的DNAA大片段段敲除，但这个个体外方方法很耗耗时费力力，更为为困难的的是取得得种系传传代。一一种基于于Cree-looxP和和同源染染色体在在减数分分裂中配配对的体体内方法法（TAAMERRE）只只可以实实现相对对较小的的DNAA片段敲敲除。另另一种利利用染色色体自然然交叉把把位于两两个不同同的同源源染色体体上的lloxPP位点转转移到同同一条

17、染染色体上上的方法法（STTRINNG）只只能敲除除非常大大的DNNA片段段（sseveerall miilliion basse ppairrs），以达到到一定的的效率。虽然这这些果蝇蝇和小鼠鼠的已有有技术还还存在着着各种各各样的缺缺憾，但但是这些些成果预预示了在在体DNNA大片片段定向向敲除新新技术新新方法研研究的发发展趋势势，以及及取得蛋蛋白质家家族整体体功能的的重大技技术突破破的可行行性。创新点：a)、单位点点打靶的的高效性性：小鼠鼠基因打打靶和果果蝇基因因打靶技技术在反反向遗传传学单位位点打靶靶研究中中是国际际上研究究蛋白质质在体功功能最尖尖端技术术之一。但是由由于实验验周期长长或打

18、靶靶效率低低等瓶颈颈问题，应用此此技术非非常耗时时费力。我们将将采用BBAC重重组技术术，结合合ET克克隆和GGateewayy克隆技技术，加加上分子子生物学学技术的的改进，大大缩缩短小鼠鼠基因打打靶质粒粒构建的的时间，进而提提高基因因打靶的的效率。b)、DNAA大片段段敲除的的定向性性：在我我们的技技术路线线中，由由于looxP和和FRTT特异性性重组位位点是通通过Caapeccchii和Goolicc基因打打靶的方方法来敲敲入到小小鼠和果果蝇基因因组中的的，因此此loxxP和FFRT特特异性重重组位点点的敲入入极具靶靶向性。通过敲敲入两个个同方向向的looxP或或FRTT位点，在位点点特异

19、性性重组酶酶Cree或Fllp的作作用下，我们就就可以取取得任何何DNAA大片段段的在体体定向敲敲除，为为蛋白质质家族整整体功能能的在体体研究开开辟了重重要途径径。c)、DNNA大片片段敲除除的在体体（inn viivo）高效性性：我们们拟开发发的基于于跨等位位基因重重组的DDNA大大片段定定向敲除除新技术术新方法法具有高高效在体体的原创创性，而而且只通通过动物物的交配配就能达达到DNNA大片片段的在在活体中中的敲除除，因此此具有简简单实用用的特点点。课题设置置：课题1、以原钙钙粘蛋白白基因簇簇为模式式来开发发小鼠在在体DNNA大片片段定向向敲除新新技术新新方法。课题研究究内容：以小鼠鼠为模式

20、式生物，以快速速单位点点基因打打靶为基基础，以以原钙粘粘蛋白为为模式基基因，通通过位点点特异性性重组酶酶催化特特异性位位点重组组，开发发DNAA大片段段定向打打靶新技技术新方方法，同同时研究究原钙粘粘蛋白基基因簇在在中枢神神经系统统发育和和小鼠行行为中的的功能。还将利用用基因编编码的新新型Caa2+荧荧光蛋白白探针在在特定细细胞、组组织、和和器官的的特异性性表达，应用电电生理及及现代光光学成像像技术，在分子子、细胞胞及整体体水平上上研究原原钙粘蛋蛋白家族族的在体功能能。课题研究究目标：开发小鼠鼠DNAA大片段段定向打打靶新技技术新方方法，同同时采用用分子遗遗传学、神经生生物学和和行为学学方法，

21、研究原原钙粘蛋蛋白基因因簇在神神经发育育和脑认认知中的的功能。承担单位位：上海海交通大大学，生生物物理理研究所所。课题负责责人：吴吴强。经费比例例：344%。课题2、果蝇DDNA大大片段定定向敲除除新技术术新方法法开发及及其在组组蛋白家家族整体体功能研研究中的的应用。课题研究究内容：在果蝇蝇中开发发、研究究大片段段DNAA在体定定向敲除除技术。用定点点敲入两两个FRRT，结结合FLLP介导导的同源源重组技技术，敲敲除果蝇蝇基因组组中靠近近着丝粒粒附近的的全部或或部分组组蛋白基基因簇。探讨不不同组蛋蛋白量对对细胞生长长的影响响及其机机制；研研究组蛋蛋白上的的表观遗遗传修饰饰的遗传机制。课题研究究

22、目标：建立高高效、实实用的果果蝇大片片段DNNA在体体定向敲敲除技术术；同过过对果蝇蝇细胞内内组蛋白白质与量量的研究究，回答答一些表表观遗传传学的核核心问题题。承担单位位：生物物物理研研究所。课题负责责人：焦焦仁杰。经费比例例：222%。课题3、利用小小鼠DNNA大片片段定向向敲除新新技术新新方法分分析黑色色素肿瘤瘤抗原蛋蛋白质家家族整体体功能。课题研究究内容：为研究黑黑色素抗抗原蛋白白质家族族在肿瘤瘤发生发发展中的的作用，我们将将建立两两个含有有不同lloxPP位点的的小鼠品品系，通通过交配配达到DDNA大大片段敲敲除目标标。我们还还将以已已有的体体外方法法作为补补充技术术进行比比较。课题研

23、究究目标：黑色素素肿瘤抗抗原蛋白白质家族族是最早早鉴定出出的肿瘤瘤抗原之之一，由由于编码码黑色素素肿瘤抗抗原蛋白白质家族族的基因因簇位于于X染色色体上，我们的的目标是是用其来来验证小小鼠DNNA大片片段定向向敲除新新技术新新方法在在X染色色体上的的应用。承担单位位：南京京大学，生物物物理研究究所。课题负责责人：夏夏焱。经费比例例：222%。课题4、小鼠和和果蝇在在体DNNA大片片段定向向敲除新新技术在在研究嗅嗅觉受体体蛋白家家族的整整体功能能中的印印证。课题研究究内容：我们将将利用DDNA大大片段定定向敲除除的新技技术对嗅嗅觉受体体蛋白质质家族进进行整体体水平上上的功能能研究。我们的的具体遗遗

24、传操作作方案是是，选择择特定的的嗅觉受受体基因因簇进行行整体的的敲除，并根据据基因簇簇内嗅觉觉受体基基因的分分类情况况在簇内内进行多多个基因因选择性性的大片片段敲除除。课题研究究目标：小鼠嗅嗅觉受体体蛋白质质家族是是最大的的蛋白质质家族，由于编编码嗅觉觉受体蛋蛋白质的的基因簇簇分布于于不同的的染色体体上，不不同染色色体区域域的嗅觉觉受体基基因簇可可以用来来验证在在体DNNA大片片段敲除除在基因因组中的的普适性性。承担单位位：生物物物理研研究所，南京大大学。课题负责责人：袁袁增强。经费比例例：222%。四个课题题之间以以及课题题与项目目目标的的关系：围绕DDNA大大片段定定向敲除除新技术术新方法

25、法研究这这一中心心，以小小鼠和果果蝇为代代表性脊脊椎动物物和无脊脊椎动物物模式生生物，我我们设置置了四个个密切相相关的课课题。课课题1和和课题22分别以以小鼠和和果蝇为为模式生生物开发发在体DDNA大大片段定定向敲除除新技术术新方法法，分别别以原钙钙粘蛋白白和组蛋蛋白基因因簇为模模式基因因，以CCre-loxxP和FFlp-FRTT系统为为基础，研发高高效实用用的DNNA大片片段定向向打靶新新技术，同时系系统地研研究原钙钙粘蛋白白和组蛋蛋白家族族在生物物活体中中的整体体功能。课题33验证此此技术在在一条特特殊的染染色体（X染色色体）上上的可行行性，系系统地研研究小鼠鼠黑色素素肿瘤抗抗原蛋白白家

26、族在在肿瘤发发生中的的整体功功能。课课题4通通过对嗅嗅觉受体体蛋白家家族的整整体功能能研究来来验证DDNA大大片段定定向敲除除新技术术新方法法在小鼠鼠和果蝇蝇中的应应用，阐阐明嗅觉觉受体蛋蛋白家族族在嗅觉觉产生中中的作用用和机制制。为了验证证在体DDNA大大片段定定向打靶靶新技术术新方法法在基因因组范围围内不同同染色体体区域的的普适性性，我们们所设置置的四个个课题分分别选择择了有代代表性的的基因簇簇：课题题一的原原钙粘蛋蛋白基因因簇位于于常染色色体的中中间区域域；课题题二的组组蛋白基基因簇位位于着丝丝粒附近近；课题题三的黑黑色素肿肿瘤抗原原蛋白基基因簇位位于性染染色体上上；课题题四的嗅嗅觉受体

27、体蛋白基基因簇位位于端粒粒附近。四、年度度计划研究内容容预期目标标第一年选取在神神经系统统发育，脑认知知功能，表观遗遗传修饰饰和肿瘤瘤发生发发展方面面具有重重大科学学意义、经过努努力可能能取得重重大功能能突破的的蛋白质质家族，包括原原钙粘蛋蛋白、组组蛋白、黑色素素肿瘤抗抗原蛋白白和嗅觉觉受体蛋蛋白等复复杂蛋白白质家族族，利用用Cappeccchi和和Gollic的的小鼠和和果蝇基基因打靶靶方法，把looxP或或FRTT定向敲敲入到选选定的单单位点中中。这些些单位点点分布于于小鼠和和果蝇的的不同染染色体区区域。1、提高高小鼠和和果蝇单单位点基基因打靶靶的效率率。2、获取取6-110个lloxPP敲入的的基因打打靶小鼠鼠品系。3、建立立5-110个FFRT敲敲入的基基因打靶靶果蝇品品系。4、取得得3-55个转基基因小鼠鼠和果蝇