食品中蛋白质含量的测定

1、蛋白质测定意义 蛋白质是食品中主要营养指标。各种不一样食品中蛋白质含量各不相同，普通说动物性食品蛋白质含量高于植物性食品，测定食品中蛋白质含量，对于评价食品营养价值、合理开发利用食品资源、提升产品质量、优化食品配方、指导经济核实及生产过程控制均含有极主要意义。蛋白质测定方法 蛋白质测定最惯用方法是凯氏定氮法，它是测定总有机氮最准确和操作较简便方法之一,应用普遍。另外，双缩脲分光光度比色法、染料结合分光光度比色法、酚试剂法等也惯用于蛋白质含量测定，因为方法简便快速，多用于生产单位质量控制分析。近年来，国外采取红外检测仪对蛋白质进行快速定量分析。第1页一、凯氏定氮法 新鲜食品中含氮化合物大多以蛋白

2、质为主体，所以检验食品中蛋白质时，往往测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法可用于全部动物性、植物性食品蛋白质含量测定，因为样品中含有少许核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，故此法结果称为粗蛋白质含量。 该法分常量法、微量法、改良凯氏定氮法、自动定氮仪法、半微量法等各种方法。第2页1、常量凯氏定氮法原理 将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中C和H被氧化为CO2和H2O逸出，而样品中有机氮转化为NH3，并与H2SO4结合成NH4SO4，此过程称为消化。加碱将消化液碱化，使NH3游离出来，再经过水蒸气蒸馏，使NH3蒸出，用硼酸

3、吸收形成硼酸铵，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，依据标准酸消耗量可计算出蛋白质含量。第3页适用范围 此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。试剂 浓硫酸 硫酸铜 硫酸钾 氢氧化钠溶液：400g/L硼酸吸收液：40g/L，称取20g硼酸溶解于500mL热水中，摇匀备用。 HCl标准溶液：0.1000mol/L。 甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：5份2g/L溴甲酚绿95%乙醇溶液与1份2g/L甲基红乙醇溶液混合均匀。第4页主要仪器 如图，凯氏烧瓶（500mL)定氮蒸馏装置。第5页 准确称取固体样品0.202.00g（半固体样品2.005.00g，液体样品10.0025.00mL），小心移入干燥洁净500mL

4、凯氏烧瓶中，加入研细0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及20ml浓硫酸，小心摇匀后，按图安装消化装置，瓶颈45角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化）。样品消化 先以小火迟缓加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力保持瓶内液体微沸，消化至溶液呈蓝绿色透明后，再继续加热微沸0.5h，取下冷却，小心加入20mL水，移入100mL容量瓶中，用少许水洗定氮瓶，并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。第6页 蒸馏、吸收 按图装好蒸馏装置，在水蒸气发生瓶内加入100mL蒸馏水约2/3处、玻璃珠数粒，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生瓶内水。塞紧瓶口，冷凝管下端插入

5、吸收瓶液面下（瓶内预先装有10mL 20gL硼酸溶液及混合指示剂12滴）。准确吸收10mL样品处理液由小漏斗流入反应室，并以10mL水洗涤小烧杯使之流入反应室内，塞紧玻璃塞。从安全漏斗中慢慢加入10mL400g/L氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。用直火加热蒸馏30min，将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏1min，用蒸馏水淋洗尖端后停顿蒸馏。第7页滴定： 将接收瓶内硼酸液用0.1000mol/L盐酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。结果计算式中-蛋白质含量，g/100g；c-硫酸或盐酸标准溶液浓度，mol/L；V1-滴定样

6、品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL；V2-滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，mL；m-样品质量g，g；0.0140-1.0mL1.000mol/L硫酸（1/2H2SO4）或盐酸标准溶液相当氮质量， g/mmol ；F-氮换算为蛋白质系数。第8页2、微量凯氏定氮法原理 同常量凯氏定氮法。主要仪器 凯氏烧瓶（100mL）微量凯氏定氮装置（如图）试剂 0.01000mol/L盐酸标准溶液，其它试剂同常量凯氏定氮法。第9页操作方法 样品消化：样品消化步骤同常量法。将消化完全消化液冷却后，完全转入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。 蒸馏：按图装好微量定氮装置，准确量取消化稀释液10mL于反

7、应管内，经漏斗再加入10mL400g/L氢氧化钠溶液使呈强碱性，用少许蒸馏水洗漏斗数次，夹好漏斗，进行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有10mL40g/L（或20g/L）硼酸吸收液液面下。蒸馏至吸收液中所加混合指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏10min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停顿蒸馏。馏出液用标准溶液滴定至微红色为终点。同时做一空白试验。第10页 凯氏定氮法是各种测定蛋白质含量方法基础，但操作费时，且在操作中会产生大量有害气体而污染工作环境，影响操作人员健康。而分光光度测定法不但能满足对工艺过程快速控制分析，而且含有环境污染少，操作简便省时等特点。基本原

8、理：食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后在pH=4.8乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比较定量，结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。二、蛋白质分光光度测定法第11页试剂 氢氧化钠溶液：300g/L。 乙酸：1mol/L。对硝基苯酚指示剂溶液：乙酸钠-乙酸缓冲溶液：pH=4.8。显色剂：15mL37%甲醛与7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100mL,猛烈振摇，混匀（室温下放置稳定3日）。主要仪器：分光光度计；电热恒温水浴锅（1000.5

9、）；10mL具塞玻璃比色管。第12页氨氮标准贮备溶液：1.0g/L。精密称取105干燥2h硫酸铵0.472g，加水溶解后移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，混匀。此溶液每升相当于1.0mgNH3-N（10下贮存稳定1年以上）氨氮标准使用溶液：0.1g/L。用移液管精密吸收10mL氨氮标准贮备溶液（1.0mg/mL）于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液每毫升相当于100gNH3-N。第13页操作方法精密称取经粉碎混匀过40目筛固体试样0.10.5g或半固体试样0.21.0g，或吸收液体试样15mL，移入干燥100mL或250mL定氮瓶中，加0.1g硫酸铜、1g硫酸钾及5mL硫酸，

10、摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45斜支于有小孔石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化、泡沫完全停顿后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加入20mL水，放冷后移入50mL或100mL容量瓶中，并用少许水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理试样相同量硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。第14页精密吸收25mL试样或试剂空白消化液于50mL或100mL容量瓶内，加12滴对硝基苯酚指示剂溶液（1g/L），摇匀后滴加氢氧化钠溶液（300g/L）中和至黄色，再滴加乙酸（1mol/L）至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。

11、精密吸收0.0mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL氨氮标准使用溶液（相当于0.0g、5.0g、10.0g、20.0g、40.0g、60g、80.0g、100.0gNH3-N），分别置于10mL比色管中。加4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH=4.8）及4mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀，置于100水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色皿内，以空白为参比，于400nm波优点测量吸光度，依据标准各点吸光度绘制标准曲线。第15页精密吸收0.52.0mL（约相当于氮小于100g）试样溶液和同量试剂空白溶液，分别于10mL比色管中。加4mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4显色剂，加水稀释至刻度，混匀，置于100水浴中加热15min。取出用水冷却至室温后，移入1cm比色皿内，以空白为参比，于波长400nm处测量吸光度。试样吸光度与标准曲线比较定量求