纳米稀土荧光材料与时间分辨荧光免疫分析-硅胶包裹纳米铽荧

1、PAGE PAGE 5纳米稀土荧光材料与时间分辨荧光免疫分析作 者：叶志强, 谭明乾 指导教师：袁景利, 王桂兰一室101组摘要：在在油包水水型的微微乳液中中，合成成了三种种形状规规则、尺尺寸均匀匀的硅胶胶基质纳纳米稀土土荧光材材料。与与前驱体体相比，新型荧荧光纳米米微粒具具有更强强的荧光光强度和和抗光漂漂白性能能。将纳纳米微粒粒表面修修饰并标标记链酶酶亲和素素SA（或抗体体）后应应用于时时间分辨辨荧光免免疫分析析，建立立了人血血清中前前列腺特特异抗原原（PSSA）、甲胎蛋蛋白（AAFP）和乙肝肝表面抗抗原（HHBsAAg）的的高灵敏敏度检测测方法。关键词：荧光纳纳米微粒粒；稀土土配合物物；生

2、物物标记；时间分分辨荧光光免疫分分析。 时间间分辨荧荧光生物物分析技技术是基基于稀土土荧光化化合物特特殊荧光光性质而而建立起起来的一一种高灵灵敏度分分析方法法，现已广广泛应用用于免疫疫测定、DNAA杂交测测定和荧荧光显微微镜成像像测定等等生化检检测的领领域1。该技技术利用用具有荧荧光寿命命长、SStokkes 位移大大和半峰峰宽窄等等特点的的稀土荧荧光配合合物作为为标记物物，不仅仅适用于于多标记记分析，而且可可完全消消除各种种散乱光光和短寿寿命荧光光对测定定的干扰扰，从而而实现超超高灵敏敏度分析析。基于于这些优优点，时时间分辨辨荧光生生物分析析技术在近20年来来取得了了重大的的发展，在在临床医

3、学学与生命命科学的的实践与与研究中中发挥着着重要的的作用。近年来，纳米尺尺度发光光材料在在生化分分析领域域中的作作用受到到了越来来越多的的关注。量子点点2、胶体体金3、核壳壳型荧光光探针44等纳米米颗粒作作为标记记物已经经开始应应用于生生化检测测领域。但是由由于纳米米尺度的的发光粒粒子的瑞瑞利、拉拉曼和丁丁达尔散散射产生生的背景景光对测测定的严严重干扰扰,影响响了检测测结果的的灵敏度度、精密度度和准确确度，无无法实现现高灵敏敏的定量量分析。在我们的的研究中中，综合合稀土荧荧光标记记物和纳纳米技术术的优势势，合成成了三种种具有长长寿命荧荧光的纳纳米稀土土荧光微微粒5-7。新新型纳米米荧光微微粒用

4、于于时间分分辨荧光光生物分分子分析析，不仅仅可从根根本上彻彻底消除除各种散散乱光和和短寿命命荧光对对测定的的干扰，提高分分析方法法的灵敏敏度,而而且由于于荧光配配合物被被包覆在在硅胶的的骨架结结构中,基本隔隔绝了外外部环境境对配合合物的影影响，极极大地增增强了荧荧光材料料的光稳稳定性。实验部分分1.掺杂杂型纳米米荧光微微粒的制制备将1600mg N,NN,N11,N1-22, 66-biis(33-amminoometthyll-1-pyyrazzolyyl)-pheenyll- ppyriidinnettetrrakiis(aacettatee)-Tbb3+（BBPTAA-Tbb3+）溶溶于

5、1.1 mml的水水后和2200l的四四乙氧基基硅（TTEOSS）搅拌拌下加入入到1000 mml的圆圆底烧瓶瓶中，然然后再分分别加入入2.337 gg Trritoon XX-1000、11.877 g 正己醇醇和7.25gg环己烷烷，制成成W/OO型微乳乳液，在在剧烈搅搅拌下向向其中加加入含有有2.337 gg Trritoon XX-1000、11.877 g正正己醇、7.225g环环己烷及及2000l浓氨氨水的另另一种微微乳液。室温搅搅拌反应应24小小时后，加入550 mml丙酮酮结束反反应。将将反应液液离心后后除去上上清液，沉淀部部分用乙乙醇和二二次蒸馏馏水各洗洗三次，真空干干燥后得

6、得到白色色硅胶包包裹BPPTA-Tb33+纳米米荧光微微粒。2.掺杂杂型纳米米荧光微微粒用于于测定人人血清样样品中的的PSAA将含抗人人PSAA单克隆隆抗体（10 g/mml）的的pH值值为9.6的00.1 moll/L的的碳酸钠钠缓冲溶溶液500 l分注注于966微孔板板的各孔孔中，44 oC, 24小小时包被被后，将将PSAA标准溶溶液（用用5% BSAA-0.9% NaCCl-00.1% NaaN3的pHH值7.8的00.055 mool/LL Trris-HCll溶液制制备）或或血清样样品455 l注入入上述包包被后的的微孔板板中。337 00C，11小时反反应后，用含有有0.005%

7、 Tweeen 20 的pHH值7.8的00.055 mool/LL Trris-HCll缓冲溶溶液（缓缓冲溶液液1）洗洗两次，再用ppH值77.8的的0.005 mmol/L TTriss-HCCl缓冲冲溶液（缓冲溶溶液2）洗一次次，然后后加入445 l生物物素标记记的抗PPSA抗抗体溶液液，377 0C，11小时反反应后，用缓冲冲溶液11洗两次次，缓冲冲溶液22洗一次次，再加加入455 l 纳纳米微粒粒标记的的SA溶溶液，337 00C，11小时反反应后，用缓冲冲溶液11洗4次次，然后后进行固固相时间间分辨荧荧光测定定。 3.共聚聚合型纳纳米荧光光微粒的的制备将1600mg BPTTA-T

8、Tb3+溶于11.1 ml的的水后和和2000l的TTEOSS搅拌下下加入到到1000 mll的圆底底烧瓶中中，然后后再分别别加入22.377 g Triitonn X-1000、1.87 g正辛辛醇及77.255g环己己烷，制制成W/O型微微乳液，在剧烈烈搅拌下下向其中中加入含含有2.37 g TTritton X-1100、1.887 gg正辛醇醇、7.25gg环己烷烷及2000l浓氨氨水的另另一种微微乳液。室温搅搅拌反应应5小时时后，加加入6 l的33-22-(22-amminooethhylaaminno)eethyylamminooprropyyl- triimetthoxxysii

9、lanne（AAEPSS），继继续搅拌拌19小小时后，加入550 mml丙酮酮结束反反应。将将反应液液离心后后除去上上清液，沉淀部部分用乙乙醇和二二次蒸馏馏水分别别洗三次次，真空空干燥后后得到白白色的共共聚合型型硅胶包包裹BPPTA-Tb33+纳米米荧光微微粒。4.共聚聚合型荧荧光纳米米微粒用用于测定定人血清清样品中中的AFFP将含抗人人AFPP单克隆隆抗体（10 g/mml）的的pH值值为9.6的00.1 moll/L碳碳酸钠缓缓冲溶液液50 l分注注于966微孔板板的各孔孔中，44 0C, 24小小时包被被后将AAFP标标准溶液液或血清清样品445 l注入入上述包包被后的的微孔板板中，33

10、7 00C，11小时反反应后，用缓冲冲溶液11洗两次次，缓冲冲溶液22洗一次次。加入入45 l纳米米荧光微微粒标记记的抗AAFP多多抗溶液液，377 0C，11小时反反应后，用缓冲冲溶液11洗4次次，然后后进行固固相时间间分辨荧荧光测定定。5. 共共价键合合型荧光光纳米微微粒的制制备将10.4mgg氨丙基基三乙氧氧基硅 (APPS，447 moll)，77.1moll4,44-biis(11, 1,1,2,2,3,3-hepptaffluooro-4,6-hexxaneedioon-66-yyl)-chlloroosullfo-o- tterpphennyl (BHHHCTT)及33.555m

11、ollEuCCl36H2O 加加入300 l环己己烷中，超声振振荡反应应15分分钟后，反应液液加入到到含有11.1 ml水水，4.74 g TTritton X-1100、3.664 gg正辛醇醇及144.500 g环环己烷的的W/OO型微乳乳液中，搅拌00.5小小时后，加入2200 l的TTEOSS和2000 l的浓浓氨水。室温搅搅拌反应应24小小时后，加入440 mml丙酮酮结束反反应。将将反应液液离心后后除去上上清液，沉淀部部分用乙乙醇和二二次蒸馏馏水分别别洗三次次后悬浮浮于水中中备用。6. 共共价键合合型纳米米微粒用用于人血血清中乙乙肝表面面抗原（HBssAg）测定使用抗HHBsAAg

12、单抗抗和多抗抗进行测测定，测测定步骤骤与掺杂杂型纳米米荧光微微粒测定定人血清清中PSSA相同同。结果和讨讨论 1. 掺掺杂型纳纳米荧光光微粒的的制备及及时间分分辨荧光光免疫测测定PSSA掺杂型纳纳米荧光光微粒的的制备原原理见图图1。在在表面活活性剂和和助表面面活性剂剂的作用用下，含有 TEOOS,BBPTAA-Tbb3+的水水溶液在在油相中中形成均均匀的小小液室，每一个个小液室室相当于于一个微微反应器器，TEOOS的水水合化和和聚合化化的过程程都被限限制在微微反应器器内。微反应应器的体体积主要要由水和和表面活活性剂的的比值所所决定，而微反反应器的的体积大大小又决决定了纳纳米颗粒粒的尺寸寸大小。

13、我们用用这种方方法制备备了直径径在422 33 nmm的纳米米颗粒(图2)，由电镜镜照片可可以看出出纳米颗颗粒形状状规则、尺寸均均匀。图1 在在微乳液液中制备备纳米微微粒的原原理 图图2 硅硅胶包裹裹BPTTA-TTb3+纳米微微粒的电电镜照片片纳米荧光光微粒表表面的硅硅胶经过过修饰后后可与生生物分子子相连。将纳米米荧光微微粒与SSA共价价结合后后，可用用于时间间分辨荧荧光免疫疫测定。PSAA是前列列腺癌诊诊断的一一个重要要指标，现用于于临床检检测的方方法主要要有放射射性免疫疫法和酶酶联免疫疫法，它它们的检检测灵敏敏度大约约在1000pgg/ml左右。而最近近的研究究表明，如果方方法的检检测灵

14、敏敏度可达达到200 pgg/ml以下，那么至至少可以以提前一一年诊断断出治疗疗后前列列腺癌患患者是否否复发。所以发发展高灵灵敏度的的血中PPSA的的检测方方法显得得十分重重要。使使用BPPTA-TTb3+纳米微微粒标记记SA的的时间分分辨荧光光免疫分分析法测测定PSSA的工工作曲线线如图33所示，方法的的最低检检测限为为7 ppg/mml（用用本底信信号标准准偏差的的3倍计计算）。使用本本方法对对24个个人血清清样品的的PSAA浓度进进行了测测定，并并与临床床测定的的结果进进行了比比较，两两者的相相关性见见图4。两种方方法对224个人人血清样样品中PPSA浓浓度测定定结果的的相关性性方程式式

15、为y1.001x0.0008，相关系系数为00.9998，说说明使用用纳米微微粒作为为标记物物的测定定方法的的结果是是完全可可信的。图3用硅硅胶包裹裹BPTAA-Tbb3+纳米微微粒标记记SA 图44 新方方法和临临床检测测法用于于24个个人血清清的时间分分辨荧光光免疫测测定PSSA的工工作曲线线 样品品中PSSA浓度度测定的的相关性性2. 共共聚合型型纳米荧荧光微粒粒的制备备及时间间分辨荧荧光免疫疫测定AAFPAEPSS和TEEOS一一样，都都可以在在氨水存存在的条条件下发发生水解解和聚合合反应。而且它它具有的的活性基基团-NNH2在聚合合后会存存在于纳纳米微粒粒的表面面，为后后续标记记生物

16、分分子提供供极大的的方便。所以，在我们们的研究究中利用用将AEEPS和和TEOOS共聚聚合的方方法在微微乳液中中制备出出了表面面带有活活性氨基基的功能能性硅胶胶包裹铽铽配合物物纳米荧荧光微粒粒。其电电镜测定定结果（见图55）显示示这种纳纳米微粒粒不仅形形状规则则，而且且粒径分分布范围围窄(4453nm)。聚合后后存在于于纳米微微粒表面面的-NNH2基团使使得生物物标记更更加容易易。通过过简单的的方法将将纳米微微粒与抗抗AFPP抗体结结合后，建立了了一种以以纳米微微粒为标标记物的的时间分分辨荧光光免疫分分析方法法用于人人血清中中AFPP的测定定，其工工作曲线线见图66。本方法法的最低低检测限限为

17、0.1 nng/mml，相相对标准准偏差（CV%）小于于9.00%，血清清添加回回收率在在84.0-98.0%范围，说明该该法具有有较高的的精密度度和准确确度，可可以用于于人血清清样品的的测定。图5功能能性铽纳纳米荧光光微粒的的电镜照照片 图6 测定定AFPP的工作作曲线3. 共共价键合合型纳米米荧光微微粒的制制备及时时间分辨辨荧光免免疫测定定HBssAgBHHCCT-EEu3+是一种种强荧光光性铕配配合物，只是它它的水溶溶性较差差，所以以在用掺掺杂型方方法制备备纳米微微粒时只只有少量量的配合合物被包包进纳米米微粒中中，导致致制得的的纳米微微粒荧光光很弱。而采用用共价键键合的方方法则不不但可以

18、以增加每每个纳米米微粒中中所包含含BHHHCT-Eu3+分子的的个数，从而使使得纳米米微粒的的荧光强强度得到到大幅度度提高，而且一一次性地地在纳米米微粒表表面导入入了自由由氨基。电镜测测定结果果（见图图7）显显示该法法制得的的纳米微微粒大小小均匀，粒径为为373nm。图7 共共价键合合型纳米米微粒的的电镜照照片 图图8. 纳米微微粒标记记SA（a）和和BHHHCT-Eu3+标记SSA-BBSA（b）测测定人血血清中HHBsAAg的工工作曲线线将纳米微微粒与SSA结合合后，用用于时间间分辨荧荧光免疫疫测定人人血清中中的HBBsAgg，其工工作曲线线见图88a。本本法的最最低检测测限为223pg/

19、ml，证明其其灵敏度度要高于于直接使使用BHHHCTT-Euu3+为标标记物的的测定方方法（图图8b，最低检检测限为为84pgg/mll）。该该法用于于人血清清样品测测定的相相对标准准偏差小小于100%，添加回回收率在在80-1100%范围，说明该该法具有有较高的的精密度度和准确确度。结论本研究利利用微乳乳液法制制备了三三种硅胶胶基质纳纳米稀土土荧光微微粒，制制备方法法简单且且重复性性好。所所制备的的纳米微微粒形状状规则、尺寸均均匀，在在对其进进行表面面修饰后后用于生生物标记记及时间间分辨荧荧光免疫疫测定，建立了了人血清清中PSSA、AFPP及HBsAAg的高高灵敏度度定量测测定方法法。由于于

20、新型稀稀土荧光光微粒具具有强荧荧光、强强抗光漂漂白性能能及易用用于生物物标记等等优点，预计其其在荧光光显微镜镜生物成成像测定定及生物物芯片等等领域也也有重要要的应用用前景，这部分分的研究究工作将将在近期期展开。注：本文文系由中中国科学学院领域域前沿项项目大大连化物物所青年年基金资资助参考文献献：Soinni, E.; Lvgrren, T.CRCC Crrit. Reev. Anaal. Cheem. 19887, 18, 1055-1554.Tayllor, J. R.;Faang, M. M.;Niee, SS. AAnall. CChemm. 20000. 72. 19779-11986

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