生化技术1课件

1、生物化学与分子生物学技术杨建雄导 论1 生物化学与分子生物学的定义 生物化学(1877年词汇出现，上世纪初形成学科）是用化学的理论和方法研究生命现象的科学。 分子生物学（上世纪70年代形成较完整的学科，出现教科书）是研究生物大分子结构和功能的学科，狭义的分子生物学只研究基因的表达及其调控。 生物化学与分子生物学是同一个二级学科，在大学本科阶段可以作为两门课开设， 也可以作为一门课开设。2 生物化学与分子生物学的研究范畴2.1 生物体的组成物质 即静态生物化学，重点是糖类、脂类、蛋白质、酶、核酸的结构和功能。 复杂性: 组成物质多；分子大；空间结构复杂。 规律性: 元素构件小分子聚合物（生物大分

2、子）；结构与功能相适应。 方法：分离纯化；序列分析；结构和功能的研究。免疫球蛋白部分分子的空间结构2.2 物质和能量代谢（动态生物化学） 重点是糖类和氨基酸的分解代谢、脂类和核苷酸的分解和合成代谢，及物质代谢和能量代谢的关系，还应熟悉氨基酸生物合成、光合作用和生物固氮的概况。复杂性 多步化学反应构成代谢途径； 多条代谢途径相互交织成网； 物质代谢和能量代谢相互交织； 调节控制有条不紊。规律性 反应类型不多； 反应机理符合有机化学理论； 调节控制与生物学功能相适应。方法 分析中间代谢物； 示踪技术； 酶学研究（包括使用抑制剂）； 研究缺陷性和疾病模型。1点1线或1点2线:410个；1点3线:71

3、个；1点4线:20个；1点5线:11个；1点6线或6线以上:8个；1点1线在1个途径的末端；1点2线在1个途径的中间；1点3线参与2个途径；其余类推。3 生物化学与分子生物学同生产实践的关系启蒙阶段 食品选择和加工； 医疗。发展阶段 维生素、抗生素医疗； 代谢食品、医疗； 分子生物学 基因工程、蛋白质工程。发展前景 生物制品； 转基因动植物； 基因芯片； 基因诊断； 基因治疗。5 生物化学实验技术发展简史1920年代 微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等的发现。 瑞典著名的化学家Svedberg奠基了超离心技术的理论基础，1924年制成了第一台5000 RCF的离心机（5000 r/min8

4、000 r/min，相对离心力“RCF”的单位可表示为“g”)，并准确测定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，获得了1926年的诺贝尔化学奖。1930年代 电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看到细胞内的结构和某些生物大分子的大致结构。 美国哈佛大学的Folin教授和中国的吴宪教授建立了不少生物化学常用的分析方法如血糖分析、蛋白质含量分析、氨基酸测定等。 1935年Schoenheimer和Rittenberg首次将放射性同位素示踪用于碳水化合物及类脂物质的中间代谢的研究，1937年英藉德裔生物化学家Krebs发现了三羧酸循环，对细胞代谢及分子生物学的研究作出了重要贡献，他与美藉德裔生物化学家

5、Lipmann共获1953年诺贝尔生理医学奖。1940年代 两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化物质的关键技术。 电泳技术由瑞典的著名科学家Tisellius奠基，从而开创了电泳技术的新时代，他因此获得了1948年的诺贝尔化学奖。 层析技术和电泳技术用于分析生物大分子的组成和代谢的中间产物，示踪技术的应用推动了代谢的研究。 美国化学家Pauling确认氢键在蛋白质空间结构中以及生物大分子间相互作用的重要性，发现了蛋白质的-螺旋，并因此而获得了诺贝尔化学奖。1950年代 放射性同位素示踪技术有了大的发展，为各

6、种生物化学代谢过程的阐明发挥了重要作用。 1953年Wilkins和Franklin通过对DNA分子的X-射线衍射研究为Watson和Crick的DNA模型提供了有力的实验证据，美国科学家Watson和英国科学家Crick提出DNA分子的双螺旋模型，1962年与英国科学家Wilkins分享诺贝尔生理医学奖， DNA双螺旋模型的提出开创了生物科学的历史新纪元。 英国物理学家Perutz对血红蛋白的结构进行X-射线结构分析, Kendrew测定了肌红蛋白的结构，成为研究生物大分子立体结构的先驱，他们同获1962年诺贝尔化学奖。 英国生物化学家Sanger还于1953年确定了牛胰岛素中氨基酸的顺序而

7、获得1958年的诺贝尔化学奖。 1956年Arthur Kornberg发现了DNA聚合酶I，美藉西班牙裔科学家Uchoa发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。两人分享了1959年诺贝尔生理医学奖。 美国生物化学家Nirenberg在破译遗传密码方面作出了重要贡献，Holly阐明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸排列顺序，后来证明所有tRNA的结构均相似。美藉印度裔生物化学家Khorana提出按预定的序列合成核酸分子的方法。他们3人共获1969年诺贝尔生理医学奖。 法国生物学家Lwoff因发现溶原现象，Jacob和生物化学家Monod由于发现

8、操纵子，而分享1965年诺贝尔生理医学奖。1970年代： 基因工程技术取得了突破性的进展，Arber，Smith和Nathans三个小组发现并纯化了限制性内切酶，1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次用限制性内切酶切割了DNA分子，并实现了DNA分子的重组。1973年，又由美国斯坦福大学的Cohen等人第一次完成了DNA重组体的转化技术，这一年被定为基因工程的诞生年，Cohen成为基因工程的创始人，从此，生物化学进入了一个新的大发展时期。与此同时，各种仪器分析手段进一步发展，制成了DNA序列测定仪、DNA合成仪等。 1984年德国科学家Kohler、美国科学家Milstein和丹麦科学家

9、Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而共享了诺贝尔生理医学奖。 1985年美国加利福尼亚州Cetus公司的Mullis等发明了用PCR技术（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应扩增DNA的技术，对于生物化学和分子生物学的研究工作具有划时代的意义，因而与第一个设计基因定点突变的Smith共享1993年的诺贝尔化学奖 1988年，美国遗传学家McClintock由于在二十世纪五十年代提出并发现了可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖。 1989年，美国科学家Altman和Cech由于发现某些RNA具有酶的功能（称为核酶）而共享诺贝尔化学奖

10、。1990年代： 1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在断裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理医学奖。 1994年，美国科学家Gilman和Rodbell由于发现了G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖。 1995年，美国科学家Lewis、德国科学家Nusslein-Volhard和美国科学家Wieschaus由于在20世纪4070年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发育基因而共享诺贝尔生理医学奖。 质谱技术用于蛋白质的序列测定，核磁共振技术用于蛋白质空间结构的研究，推动了蛋白质组学的发展。 进入21世纪以来，PCR技术、生物芯片技术不断完善，基因组学、蛋白质组学、生物信息

11、学发展迅速。1930Fischer德国研究血红素和叶绿素，合成了血红素1931Warburg德国发现呼吸酶及作用方式1937Haworth英国用透视式（Haworth式）表示单糖的环状结构1937Kuhn，Karrer瑞士测定了VB2的结构，阐明了VB2 与辅酶的关系1938Riehard Kuhn德国研究类胡萝卜素和维生素1939Butenandt德国发现了性激素1939Domagk德国发现磺胺类药物的抗菌作用1943HevesyDamDoisy匈牙利丹麦美国用同位素示踪法研究化学反应过程发现维生素K的化学性质1945FlemingFlorey英国澳大利亚发现青霉素及其在治疗各种传染病中效果

12、1946Sumner美国分离和提纯了结晶蛋白酶1947Robinson英国研究生物碱和其它植物制品1947C.F.CoriG.T.Cori美国美国发现糖代谢中的酶促反应1948Tiselius瑞典发明了电泳技术并发现血清蛋白的组分1950KendallHenchReichstein美国美国瑞士发现肾上腺皮质激素及其结构和生理效应1952Martin英国发明了分配色谱技术1952Waksman美国发现链霉素1953Lipmann，Krebs英国发现辅酶A/发现克雷布斯循环（三羧酸循环）1954Linus Pauling美国研究化学键的本质，发现螺旋1955Vigneaud美国发现了生物化学中的重

13、要含硫化合物，合成了多肽激素1955Theorell瑞典发现了过氧化酶的性质和作用方式1957Todd英国阐明了核苷酸和核苷酸辅酶的关系1958Sanger英国阐明了胰岛素的一级结构1959KornbergOchoa美国美国在大肠杆菌中发现了DNA聚合酶1970Leloir阿根廷发现核苷酸及其在碳水化合物合成中的作用1971Sutherland美国发现了cAMP 及作为第二信使的作用1972AnfinsenMooreStein美国美国美国研究酶化学的基本理论1972EdelmanPorter美国英国测定了抗体蛋白分子的一级结构1975Cornforth英国研究有机分子和酶催化反应的立体化学19

14、77GuilleminSchallyYalow美国美国美国发现大脑分泌的多肽类激素提出多肽类激素的放射免疫分析法1978Mitchell英国提出化学渗透学说以解释氧化磷酸化的作用机制1978ArberNathansSmith瑞士美国美国发现限制性内切酶以及在分子遗传学方面的应用1980SangerGilbert英国美国建立DNA双脱氧链中止法测序建立DNA化学法测序1982Klug英国以电子显微镜和X射线衍射法研究核酸-蛋白质复合体1983McClintock美国发现可移动的基因1984Merifield美国研究多肽的合成1985BrownGoldstein美国美国关于胆固醇代谢调控的研究19

15、86CohenMontalcini美国意大利发现生长因子1987 Pedersen美国合成能模拟重要生物过程的有机化合物，为超分子化学奠定基础1988HuberDeisehoferMichel德国德国德国确定了光合作用反应中心的立体结构1989CechAltman美国发现了核酶，即核糖核酸具有酶的催化功能1992Fischer美国发现酶磷酸化和去磷酸化的调控作用1993MullisSmith美国加拿大发明多聚酶链式反应（PCR）技术提出寡聚核苷酸定点突变1993RobertsSharp美国美国发现断裂基因1994GilmanRodbell美国美国发现G蛋白1997Prusiner美国发现朊病毒

16、1997SkouWalkerBoyer丹麦英国美国发现ATP合成的分子机制2002Wiithrich田中耕一Fenn瑞士日本美国用核磁共振(NMR)检测生物大分子的结构2004Aaron Ciechanover Avram HershkoIrwin Rose以色列以色列美国发现泛素调控的蛋白质降解2006FireMello美国美国发现了RNA干扰机制2008钱永健ChalfieOsamu Shimomura美籍华裔美国美籍日裔发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)我国生物化学界的主要成就 我国生物化学界的先驱吴宪教授在20年代初由美回国后，在协和医科大学生化系与汪猷、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理

17、论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究。 1965年我国用化学方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，1983年又通过大协作完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工合成。近年来，在酶学研究、蛋白质结构及生物膜的结构与功能等方面都有举世瞩目的研究成果。 90年代以来，我国参与了人类基因组计划，在水稻基因组研究中处于国际领先水平，在功能基因组学研究中也取得不少成绩。6 学习方法 （1）要有良好的精神状态。生物化学与分子生物学内容复杂而且抽象，学生学习时容易产生畏难情绪，积极培养学习的兴趣，以良好的精神状态进行学习，才能有好的学习效果。 （2）要注意记忆与理解的相互促进。生物化学

18、与分子生物学内容十分丰富，有不少知识点需要记忆，丰富的记忆材料是良好理解能力的基础，对问题的理解又可以促进记忆，学生在学习中应注意锻炼记忆与理解的相互促进的学习方法。 （3）要注重阅读和练习。生物化学与分子生物学的有些内容特别复杂，学生读一本书或听一次课有时对问题的理解不深，如果能读多本书，不同的书叙述问题的角度不同，有助于学生加强对问题的理解。这门课有不少内容需要用化学的理论进行一定的计算，还有一些内容需要用实验现象来分析一定的问题，这就需要学生通过作业来练习。因此，加强阅读和练习至关重要。 （4）注重学习科学思维的方法和实验技能。生物化学与分子生物学是一门实验学科，绝大部分知识和理论都是通

19、过实验发现的，了解重要科学发现的思路和主要途径，对于培养学生科学思维的能力和创新能力十分重要。本课程的教学过程中将会介绍一些相关的内容，希望引起同学的足够重视。实验技能对于获取新知识十分重要，一定要给与足够的关注，阅读相关的书籍，进行必要的实验技能训练。 （5）注重与数理化特别是化学知识的联系。生物化学与分子生物学是以数理化特别是化学为基础的。用化学理论来探索生物体的物质组成、有关物质的性质和代谢、与此相关的研究方法，构成了生物化学与分子生物学的基本内容，因此，学习生物化学与分子生物学一定要有很好的化学基础。数学、物理学和信息科学为生物化学与分子生物学提供研究思路和手段，生物化学与分子生物学的

20、许多重大突破是由化学家和物理学家完成的，从一个侧面说明了数理化对于生物化学与分子生物学十分重要。 （6）注重与生物学功能的联系。生物化学与分子生物学是以生物体为研究对象的，对生物学的基本知识了解越多，学习生物化学与分子生物学就越容易，生物体内的物质组成、组成物质的性质、代谢和调控都是与其生物学功能相适应的。因此，从生物学功能的角度理解问题，可以显著的提高学习的效率。 参考书1.王镜岩等. 生物化学. 高等教育出版社, 2002, 第3版.(260万字)2.王镜岩等. 生物化学教程. 高等教育出版社, 2008. (140万字)3.张丽萍, 杨建雄. 生物化学简明教程, 高等教育出版社, 200

21、9, 第4版. (69万字)4.郑集, 陈均辉.普通生物化学, 高等教育出版社,2007,第4版.(130万字)5.杨荣武. 生物化学原理. 高等教育出版社, 2006. (180万字)6. David L, Nelson and Michael M.Cox, Lehninger Principles of Biochemistry. W H Freeman & Co Publishers,2004 (Fourth dition). 周海梦等译, 第3版中译本, 2005, 高等教育出版社.7.黄熙泰, 于自然, 李翠凤. 现代生物化学. 化学工业出版社, 2005, 第2版.(85.8万字)

22、8.Garrett, and Grisham, Biochemistry(第3版, 影印版). 2005, 高等教育出版社.9.张楚富. 生物化学原理. 高等教育出版社, 2003. (108万字)10.周爱儒, 查锡良. 生物化学. 人民卫生出版社, 2006, 第6版.11.贾弘禔, 屈伸. 生物化学(七年制)，人民卫生出版社, 2006, 第6版.12. 杨建雄. 分子生物学, 化学工业出版社, 2009, 第1版.13.朱玉贤, 李毅. 现代分子生物学, 高等教育出版社, 2008, 第3版.14.杨荣武. 分子生物学, 南京大学出版社, 2007, 第1版.15.王曼莹. 分子生物学

23、, 科学出版社, 2006, 第1版.16.赵亚华. 分子生物学教程, 科学出版社, 2006, 第2版. 17. 杨岐生. 分子生物学, 浙江大学出版社, 2004, 第1版. 18. Benjemin Lewin,Genes , Pearson Education,Inc,2004. 赵寿元译.科学出版社,2007,第1版. 19. 本杰明.卢因著,赵寿元译,基因精要,科学出版社,2007,第1版. 20. James D.Watson et al. Molecular biologe of the gene 5thed., Benjemin Cummings, 2004. 杨焕民等译.科

24、学出版社,2005.21. Robert F.Weaver,Molecular biology 3thed.,McGraw-Hill Companies, 2004. 2thed. 影印版,科学出版社,2001. 22. 杨建雄. 生物化学与分子生物学实验技术教程, 2009, 科学出 版社,第2版.23. 赵永芳.生物化学技术原理与应用,科学出版社,2008,第4版.24. 郭霭光, 郭泽坤. 生物化学实验技术. 高等教育出版社, 2007.25. 黄德娟, 徐晓晖. 生物化学实验教程. 华东理工大学出版社, 2007, 第1版.26. 屈伸, 刘志国. 分子生物学实验技术. 化学工业出版社

25、, 2008.27. 赵亚力等. 分子生物学基本实验教程. 清华大学出版社, 2006.28. 奥斯伯等. 精编分子生物学实验指南, 第4版. 马学军译. 科学 出版社, 2005, 29. 萨姆布鲁克等. 分子克隆实验指南. 第3版. 黄培堂译. 科学出 版社, 2002, 30. 杨建雄. 生物化学学习指导与习题详解, 陕西师范大学出版 社, 2005.31. 张楚富.生物化学解题指导与测验, 高等教育出版社, 2004.32. 陈钧辉等. 生物化学习题解析, 科学出版社, 2002, 第2版.第一章 生物化学与分子生物学中的定量分析第一节 实验数据的处理 （一）测量误差 任何测量都是测量

26、者通过某种仪器进行的。由于受分析方法、测量仪器、试剂和分析工作者的主观因素等方面的限制，得到的测量结果不可能和真实值完全一致。在一定条件下，测量结果只能接近真实值，而不能达到真实值。 进行定量分析时，必须根据对结果准确度的要求，合理的安排实验，对实验结果的可靠性做出合理判断并予以正确表达。 误差的大小是衡量一个测量值不准确性的尺度。误差越小，说明测量的准确性越高。 测量中的误差，可以用两种方法表示。1. 绝对误差 绝对误差（absolute error）是测量值与真实值之差。 = x (：绝对误差；x：测量值；：真实值） 绝对误差以测量值的单位为单位，可以是正值，也可以是负值。测量值越接近真实

27、值，绝对误差越小。 真实值是一个可以接近而不可达到的理论值。上式可以写成： = x 说明在已知绝对误差值的情况下，真实值可以从测定值减去绝对误差而求得。2. 相对误差（relative error）： 为了反映误差在测量结果中所占的比例，分析工作中经常使用相对误差。相对误差是以真实值的大小为基础表示的误差值，没有单位。通常以%， 或 ppm表示。 /= (x -)/ 例如：测定纯NaCl中Cl的百分含量为60.52%，而其真实含量（理论值）为60.66%。则 绝对误差 = 60.52% 60.66% = 0.14% 如果不知道真实值，而知道绝对误差值，则相对误差也可以表示为： 例如：用分析天平

28、称两个重量，一个是2.1750g，另一个是0. 2715g，两个重量的绝对误差都是0.0001g，可是相对误差却大不相同， 一个是 另一个是 可见，由于两个被测组分含量高低不同，即使绝对误差相同，相对误差也不同。对高含量组分测定的相对误差应当要求小些，低含量组分测定的相对误差要求允许大些。 例如：用重量法和滴定法测量样品主要成分，相对误差需要达到千分之一，而用比色法测定样品中的微量成分时，相对误差只要求达到百分之几即可。（二）系统误差 系统误差（systematic error）也叫“可定误差”，是由某种确定的原因引起的，一般有固定的方向（正或负）和大小，重复测定时重复出现。根据系统误差的来源

29、，可分为：1. 方法误差 方法误差是由于不适当的实验设计或所选方法不恰当所引起的，通常影响较大。比如：滴定分析中终点与化学计量点不相符合、重量分析中沉淀的溶解度过大或有共沉淀等，都会产生误差。2. 仪器或试剂误差 是由于仪器未经校准或试剂不合规格引起的。例 如：天平砝码不准、容量仪器刻度不准或试剂不纯等，均能产生这种误差。3. 操作误差 操作误差是由于分析者操作不符合要求引起的。 例如：分析者对滴定终点颜色改变的判断能力不够高，总是偏深或偏浅，便会产生误差。 由于系统误差是重复的以固定方向和大小出现，所以能用加校正值的方法加以消除，但不能用增加平行测定次数的方法消除。（三）随机误差（accid

30、ental error ): 也称偶然误差，是由于偶然的原因，如测量条件、实验室温度、湿度等变动而未能得到控制的条件波动引起的，其大小和正负都不固定。 偶然误差的出现看起来似乎没有规律，但多次测量就会发现绝对值相同的正负偶然误差出现的概率大致相等，它们之间能完全或部分抵消。因此通过增加平行测定次数，就可以减免测定结果中这种误差。也可以通过统计学方法估计出偶然误差值，并在测定结果中予以正确表达。 系统误差和偶然误差往往不能区分。比如：在观察滴定终点的颜色变化时，有人总是偏深，产生系统误差。但多次测定中偏深程度不一样，又必然有偶然误差。二、准确度和精密度1. 准确度 准确度（accuracy）表示

31、分析结果与真实值接近的程度。准确度的大小，用误差表示。误差越大，准确度越低。2. 精密度 精密度（precision）表示平行测量的各测量值之间的相互接近程度，表示测量的重现性，用以下几个指标表示。（1）偏差 由于真实值通常是不知道的，因此在实际工作中无法求出数据的准确度，只得用精密度来评价分析的结果。一般用偏差来衡量分析结果的精密度，偏差也有绝对偏差和相对偏差两种表示方法。 设n次平行测定得到的数据为x1，x2，xn，其算术平均值为： 绝对偏差 = 测定值 算术平均值（不计正负号），即： 当然，与误差的表示方法一样，用相对偏差来表示实验的精确度，比用绝对偏差更有意义。此外，精密度也常用平均绝

32、对偏差和平均相对偏差来表示。平均绝对偏差是个别测定值的绝对偏差的算术平均值，平均相对偏差是个别测定值的相对偏差的算术平均值。即： 统计学常用的标准偏差（SD）和相对标准偏差（RSD）分别可定义为： 应该指出，准确度和精确度、误差和偏差具有不同的含义，不能混为一谈。准确度是表示测定值与真实值相符合的程度，用误差来衡量，误差越小，准确度愈高。精确度则表示在相同条件下多次重复测定值相符合的程度，用偏差来衡量，偏差愈小，精确度愈好。误差以真实值为标准，而偏差以平均值为标准，由于物质的真实值一般是无法知道的，我们平时所说的真实值其实只是采用各种方法进行多次平行分析所得到相对正确的平均值。用这一平均值代替

33、真实值来计算误差，得到的结果仍然只是偏差。 还应指出，用精确度来评价分析的结果是有一定局限性的。分析结果的精确度很高（即平均相对误差很小），并不一定说明实验的准确度也很高。因为如果分析过程中存在系统误差，可能并不影响每次测得数值之间的重合程度，即不影响精确度，但此分析结果却偏离真实值，也就是分析的准确度并不一定很高。当然，如果精确度不高，则无准确度可言。所以，精确度是保证准确度的先决条件。在实际分析中，首先要求良好的精确度，测定的精确度越好，得到准确结果的可能性就越大，通常进行分析时，对同一试样，必须用同样方法，在同一条件下由同一个人操作，作几个平行测定，取其平均值，测定次数越多，平均值就越接

34、近真实值。 三、提高分析准确度的方法1. 选择恰当的分析方法 不同方法的准确度和灵敏度不同，一般来说，测定常量成分的方法不要求太大的灵敏度。如重量分析法和容量分析法灵敏度虽然不高，但对常量组分的测定可以获得比较准确的结果，一般相对误差不超过千分之几。但对于微量和痕量组分的分析，常常测不出来，谈不上精确度。仪器分析法灵敏度很高，测定常量组分要高度稀释后，从样品中取一小部分进行测定，其结果无法准确。测定微量和痕量组分尽管相对误差较大，但绝对误差不大，能符合准确度的要求。 总之，必须根据分析对象，样品情况以及对分析结果的要求，选择恰当的分析方法。2. 减少偶然误差的措施 （1）平均取样 根据实验要求

35、并考虑生物材料的特殊性如动物的种属、年龄、性别、生长状态及饲养条件，选取动、植物某一新鲜组织制成匀浆后取样，细菌通常制成悬浮液，经玻璃珠打散摇匀后，再量取一定体积的菌体样品。固体样品应于取样前先进行粉碎，混匀。 （2）做平行实验 根据偶然误差出现的规律，做平行实验，计算测定量的平均值，可以有效地减少偶然误差。需要强调的是，不可将对分析仪器的重复读数看作平行实验。如用分光光度法做平行实验，必须从样品制备和显色反应起做平行实验，才有可能减少样品称量和加各种试剂时造成的偶然误差。对比色杯中同一个溶液多次读数，只能减少仪器本身造成的偶然误差，对高质量和高精度的仪器来说，这样的操作没有意义的。 除去以上

36、两类误差之外，还有因分析人员工作中的粗心大意、操作不正确引起的“过失误差”，如读错刻度读数，溶液溅出，加错试剂等，这时可能出现一个很大的“误差值”，在计算算术平均值时，应舍去此种数值。3. 减少系统误差的措施 （1）设置标准物对照 在任何测试中，甚至在使用标定仪器和基准试剂时，都应使用待测物质的标准溶液，检查方法的准确度。标准溶液应与待测溶液用完全相同的方法处理，可以画出一条以标准溶液浓度为横坐标，测定值为纵坐标的标准曲线，从待测溶液得到的测定值应落在标准曲线范围之内，能够从标准曲线读出测定数值相当于标准物的量。或者取标准物某一确定浓度的溶液与待测液以同样的方法，在相同条件下测定（标准物的组成

37、最好与待测液相似，含量也相近），得平均值 标准物的已知浓度常视为真实值，用t-检验法（参阅统计学著作）检验 与之间是否有显著性差异，即检验所采用的测定方法是否有系统误差。如果有系统误差，需对待测液的测定值加以校正。计算方法如下： 则 式中，为待测液测定值的平均值，作为校正系数。测定值经校正后，即可消除测定中的系统误差。 （2）设置空白试验 在任何测量实验中，都应设置空白溶液作为对照，以消除由于试剂中的干扰杂质或溶液对器皿的侵蚀等所产生的系统误差。用等体积的去离子水代替待测液，并严格按照待测液和标准液相同的方法及条件同时进行平行测定，所得结果称为空白值，它是由所用的试剂而不是待测物所造成的。将待

38、测物的分析结果扣除空白值，就可以得到比较准确的结果。空白值一般不应过大，特别在微量分析测定时，如果空白值太大，应将试剂加以纯化和改用其他适当的器皿。 （3）校正仪器 仪器不准确引起的系统误差，可以通过对仪器的校正来减小。为此，应该经常对测量仪器（如砝码、天平、容器等）进行校正，以减小误差，并在计算实验结果时使用校正值。 总之，在分析测定工作中，应注意合理安排实验系统，以尽量减少系统误差或使系统误差在测定中不起主要作用。四、有效数字及其运算规则 反复测量某一个量所得到的数字，常由可靠数字和欠准数字组成，如3次称量某基准物质的结果是：4.0843，4.0842合4.0844，前4位是可靠数字，第5

39、位是欠准数字。分析工作中实际测到的数字，允许最后一个数字是可疑数。由可靠数字和最后一位欠准数字（只能是一位，不能再多）组成的数字称有效数字（significant figure），有效数字反映测量值的准确度，要与测量的方法相适应。 处于大于0的数字之前的0是用于定位的无效数字，处于大于0的数字之后的0则是有效数字，如0.0520的有效数字只有3位，5前面的2个0是用于定位的无效数字，2后面的0为有效数字。 有效数字进行加减运算时，所得结果的有效数字的位数由各测量值最大欠准数字确定，如13.72 + 0.3628的和为14.08，由于13.72小数点后的第二位是欠准数字，0.3628小数点后的第

40、三位和第四位再准确都是没意义的。 有效数字进行乘除运算时，积和商的相对误差应与因数中最大的相对误差相当。一般来说，有效数字的位数，应与测量值中位数最少的数字相同。如0.159.6876的正确结果是1.5，而不应写作1.45314。但如果位数最少的因数首位是8或9，而积和商的首位不是8或9，则积和商的位数可以比有效数字最少的因数多一位。如0.91.236.1 = 39，而0.99 = 8。 有效数字的修约原则是四舍六入五成双，如23.4550.546修约为23.460.55，而28.4450.675修约为28.440.68。 为了避免在有效数字运算过程中偶然出现的连续舍4，或连续进6影响最后结果

41、，一般在运算过程中，将数据修约到比最后结果的位数多一位，一直到最后的计算结果，再修约到预定的位数。 在一般的科技文献中，有效数字的位数为34位，太多的位数是多余的，甚至是虚假的。如将称量数据写作3658.2543 0.0058 g，就是不真实的，原因是可称量3658 g的称量用具精密度不可能达到 0.0001 g。 五、实验记录 （1）实验前要弄清原理和操作方法，记录实验条件，如生物材料来源、形态特征、健康状况、选用的组织及其质量，主要仪器的型号和规格，化学试剂的规格和准确浓度等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的依据。 （2）在实验记录本上写出扼要的操作步骤（可用流程图表示），和记录

42、数据的表格等。在已设计好的记录表格上，准确记录观测数据，如称量物的质量、分光光度计的读数等，并根据仪器的精确度准确记录有效数字。例如，吸光值为0.050，不应写成0.05。 （3）完成某一个实验环节后，应对原始数据进行必要的计算，评价实验的成败。如果怀疑所记录的结果，或实验记录有遗漏和丢失，都必须重做实验，绝对不能拼凑实验数据。六、实验数据的整理和表达 要对实验数据进行必要的的整理和计算，一般用图表的形式概括实验的结果。可根据所记录数据的状况，确定用图还是用表。1. 表格 表格设计要紧凑、简明并有编号和标题，有时还需要在标题下面或表格下面标注详细的说明。表格中的数据要有单位，若所有数据的单位是

43、一致的，可将单位标注在标题后的括号内，若各行或各列的单位不同，可将单位列在每一列顶端的第一行，或每一行左端的第一列，而不要在表格的每一行中都重复地书写数据的单位。表格中的数据应有合适的位数，为此可适当调整数据的计量单位，例如浓度0.00832 mol/L最好表示为8.32 mmol/L。经多次平行实验得到的实验数据，要通过统计学处理，在表格中用列出数据。 2. 图示（1）图解 在实验报告或科研论文中，常常需要画上专用仪器的粗略草图，用图线表示层析或电泳的结果，或用流程图表示纯化的步骤。绘制层析、电泳图谱时，除比例关系可酌情安排外，层析斑点、电泳区带形状、位置、颜色及其深度、背景颜色等一定要与原

44、始记录一致。近年来薄层层析斑点和电泳条带多用照片或扫描图谱，柱层析的洗脱曲线多用从管理系统的电脑直接采集的图谱。（2）直线图、折线图和柱形图有些实验数据存在线性关系，如y和x的关系符合方程式 则以y对x作图就得到一条直线，直线的斜率是m，y轴的截距为c。有时y和x并不是线性关系，但对数据进行某种处理，仍可得到一条直线，如Lambert-Beer定律和米氏方程方程的双倒数作图。近年来有线性关系的数据常用计算机直接得出线性回归方程，实验报告或科研论文中很少再用直线图了。 有些无线性关系的数据可用折线图或柱形图，画图时，习惯把自变量（已知量）画在横轴（x轴）上，而把因变量（测量值）画在纵轴（y轴）上

45、。图应有简明的标题，清楚地标明两个轴的计量单位。要适当调整数据的计量单位，用简单数字标明轴上的标度，如使用10 mmol/L就比0.01 mol/L或10000 mol/L好。 折线图的测量点要用清晰的符号标出，符号的大小应能指示各值的误差。通过调整标度尽可能使横坐标上各点间有合适的距离，不要使各点挤在一起或距离太大。可以根据实验数据的特点，用连续的曲线或折线连接各点。 芦丁和BHT对O2-的清除作用 (meanSD, n = 3) 柱形图将测量值表示为与横轴垂直的线或棒，其长度表示因变量的大小。在横轴的同一个刻度处可以有多个柱形图标，各个柱形图标要有容易区分的标识，如横线、竖线、斜线、不同的

46、颜色等。 在折线图和柱形图中，实验数据的标准差一般在测量点的符号处用平行于纵轴的竖线标出，竖线的长度表示标准差的大小。 芦丁和绿原酸对O2-清除能力的比较 第二节 紫外可见分光光度法一、基本原理（一）Beer-Lambert 定律 当一束单色光通过溶液时，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就会减弱。设入射光的强度为I0，透过浓度为c，液层厚度为b的溶液后，透射光的强度I必定小于I0，随浓度和厚度的增加，光被吸收的程度亦增加，透射光的强度则减小。透射光强度与入射光强度的比值，称为透光度(transmittance)，以T表示。 实验证明，当液层厚度b和溶液浓度c按算术级数增加时，透光度T按几何级

47、数减小，数学式为： A：吸光度，又称光密度“O.D”； T：透光度， TI / I。； a：吸光系数（Lmol1cm1）； b：样品光程（cm），常用1.0cm 的吸收池，则b = 1cm； c：样品浓度（mol/L）。 当a、c一定时，吸光度A与液层厚度b成正比，称为朗伯定律(Lamberts law)。当a、b一定时，吸光度A与溶液浓度c成正比，称为比尔定律(Beers law)。 吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比，称为朗伯-比尔定律，简称比尔定律，即光的吸收定律。其数学表达式为： A = abc 式中的a为比例常数，称吸光系数，有两种表示方式： 1. 摩尔吸光系数，是指在一定波长时

48、，溶液浓度为1mol/L，厚度为1cm的吸光度，用或EM表示。 2. 百分吸光系数或称比吸光系数，是指在一定波长时，溶液浓度为1%(W/V)，厚度为1cm的吸光度，用E1%1cm表示。 吸光系数两种表示方式之间的关系是： 摩尔吸光系数是物质对某波长的光的吸收能力的量度。越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。值大，说明电子跃迁的几率大，通常 10105：一般认为 104为强吸收；103104 为较强吸收； 102 为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。 因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A0.001, 所以，当b1cm, 105时，可检测的溶液最小浓度是C 10-8 mol

49、/L。 的值很难直接测定，通常要先测出 ，再按公式计算求得。 吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性： 即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。 若溶液中各溶质的吸光系数相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。 例：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，已知其摩尔吸光系数 = 8.2103 M-1cm，计算其摩尔浓度。）。 A bC , A （溶剂加样品的吸光度）（溶剂的吸光度） A 0.6500.070 0.580 b 1cm C = 0.580/(8.

50、2103) = 7.110-5 mol / L（二）影响吸光系数的因素 吸光系数的大小，取决于物质(溶质、溶剂)的本性和光的波长。 1. 物质不同，则吸光系数不同。以吸光系数可作为物质的特性常数。在分光光度法中，常用摩尔吸光系数来衡量显色反应的灵敏度，值越大，灵敏度越高。 2. 溶剂不同，其吸光系数亦不同。所以在说明某一物质的吸光系数时，应注明溶剂。 3. 光的波长不同，其吸光系数亦不同。如将不同波长的单色光依次通过被分析物质，分别测得吸光度，然后绘制吸光度-波长曲线，称为吸收曲线(absorption curve)，又称吸收光谱(absorption spectrum)。由吸收曲线可以看出物

51、质的吸收特征。吸收曲线上有极大值的部分，称为吸收峰。吸收峰所对应的波长，称为最大吸收波长，以符号max表示 ，这是物质定性的依据之一。物质的定量也常选择在max处测定其吸光度，因为在此处测定的灵敏度最高。 4. 单色光的纯度也影响吸光系数。单色光越纯，即经单色器分光后的波长范围越窄，其吸光系数越大。严格说来，朗伯-比尔定律只有当入射光是单色光时才完全适用，但实际上不管仪器中光学系统的质量怎样高，单色化以后的光还是具有一定的宽度，这取决于仪器的精确程度。滤光片的分光本领较差，故一般测得的吸光系数要比真值小得多。 二、分光光度计的主要部件1. 光源 理想光源的条件是：能提供连续的辐射；光强度足够大

52、；在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化；光谱范围宽；使用寿命长，价格低。 用于可见光和近红外光区的光源是钨灯，现在最常用的是卤钨灯（Halogen lamp），即石英钨灯泡中充以卤素，以提高钨灯的寿命。适用波长范围是3201100nm。由于能量输出的波动为电压波动的四次方倍，因此电源电压必须稳定。 用于紫外光区的是氘灯（Deuterium lamp），适用波长范围是195400nm，由于氘灯寿命有限，国产氘灯寿命仅五百小时左右，要注意节约灯时。 2. 单色器 单色器是分光光度计的心脏部分，它的作用是把来自光源的混合光分解为单色光并能随意改变波长。它的主要组成部件和作用是： 入射狭缝 限制杂

53、散光进入。 色散元件 即棱镜或光栅，是核心部件，可将混合光分解为单色光。 准直镜 把来自入射狭缝的光束转化为平行光，并把来自色散元件的平行光聚焦于出射狭缝上。 出射狭缝 只让额定波长的光射出单色器。 转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长；调节出入射狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度。 3. 样品室 包括有池架、吸收池（即比色杯）、以及各种可更换的附件。池架有普通池架和恒温池架，恒温池架有水恒温池架和电恒温池架。水恒温池架需用循环水恒温装置打入循环水保持池架恒温，控温精度为 0.1，电恒温池架十分昂贵，控温精度可达 0.05。 吸收池有光学玻璃杯和石英玻璃杯两种。

54、光学玻璃杯因为普通光学玻璃吸收紫外光，因此只能用于可见光，适用波长范围是400nm2000nm。石英玻璃杯可透过紫外光、可见光和红外光，是最常使用的吸收池，使用波长范围是180nm3000nm。 吸收池使用注意事项： 要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在 1洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净，要求杯壁不挂水珠，还可以用绸布丝线或软塑料制作一个小刷子清洗杯子。 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。4. 检测

55、器 检测器是一种光电转换设备，即把光强度以电讯号显示出来，常用的检测器有光电管，光电倍增管和光电二极管等三种。 光电管 光电管可检测10微微安（10-11A）的光电流，管内抽真空充入惰性气体。 光电倍增管 它是检测弱光的最灵敏最常用的光电元件，其灵敏度比光电管高200多倍，光电子由阴极到阳极重复发射9次以上，每一个光电子最后可产生106107个电子，因此总放大倍数可达106107倍，光电倍增管的响应时间极短，能检测10-810-9秒级的脉冲光。其灵敏度与光电管一样受到暗电流的限制，暗电流主要来自阴极发射的热电子和电极间的漏电。 光电二极管 其原理是这种硅二极管受紫外-近红外辐射照射时，其导电性

56、增强的大小与光强成正比。近年来分光光度计使用光电二极管作检测器在增加，虽然其灵敏度还赶不上光电倍增管，但它的稳定性更好，使用寿命更长，价格便宜，因而许多著名品牌的高档分光光度计都在使用它作检测器。 5. 显示装置 低档分光光度计现在已都使用数字显示，有的还连有打印机。高性能分光光度计均可以连接微机，而且有的主机还使用带液晶或CRT荧屏显示的微处理机和打印绘图机，有的还带有标准软驱，存取数据更加方便。6.分光光度仪器的使用 分光光度计的种类和型号很多，操作界面和操作方法不尽相同，要仔细阅读说明书，按说明书的要求操作仪器。不过，各类仪器的操作均可看作下列几个步骤： 打开电源开关，预热仪器。 选择合

57、适的波长。 将待测溶液依次倒入比色池，达到2/3高度即可，透光面的外部要擦净。 依次将比色池垂直放入比色池架，光路要通过透光面。 将对照管置于光路，进行T调零和A调零。 依次读取样品管的数据。有多个样品时，要保留对照管，其他比色池的样品液可更换。 三、分光光度法的定性与定量方法（一）定性方法 一系列不同波长的单色光照射待测溶液，可测的一系列相应的吸光度。以吸光度为纵坐标，以波长为横坐标作图，可以得到待测物质的吸收曲线。通过与标准品比较而定性。 实际工作中常用max 和来定性，max 可以从吸收曲线中吸收峰所对应的波长直接找出； 通常需配置待测物质三种不同浓度的溶液，在1cm的吸收池中，在max

58、处分别测定其吸光度，根据A= bc,即=A/bc，计算出，将三次结果平均，即是该物质的摩尔吸光系数。从吸收光谱中初步推断官能团 一个化合物在220800nm范围内无吸收（1），它可能是脂肪族饱和碳氢化合物、醇、醚、羧酸、胺等，不含直链或环状共轭体，没有醛、酮等基团。在210250nm有吸收带，可能含量2个共轭单位，250300nm有弱吸收带，表示有羰基存在。异构体的推定 许多异构体可以利用双键位置不同，通过紫外吸收光谱推断异构体结构。化合物骨架的推定 未知化合物与已知化合物的紫外吸收光谱一致时，可以认定两者具有同样的发色团。通过这个原理可以推定未知化合物的骨架。（二）定量方法 根据比尔定律，物

59、质在一定波长处的吸光度与浓度之间有线性关系。因此，只要选择一定的波长测定溶液的吸光度，即可求出浓度。1. 吸光系数法（绝对法） 根据比尔定律A = c l ，若 l 和吸光系数或E1%1cm已知，即可根据测得的A，求出被测物的浓度。 C = A / l 通常或E1%1cm可以在手册或文献中查到。 示例见课本P10.2. 标准曲线法 在有些情况下，如单色光不纯等情况，测得的吸光值随所用仪器不同而有相当大的变化。若此时用吸光系数换算成浓度，将产生很大的误差。 但如果只用一台固定的仪器，则可认定在固定的工作状态和测定条件下，浓度与吸光度之间的关系在许多情况下是线性关系或接近于线性关系。 A = KC

60、(K只为比例常数，而非物质常数） 依据上式的关系进行定量是分光光度法中比较简便易行的方法。标准曲线的制作 （1）配置一系列浓度不同的标准溶液。 （2）在测定条件相同的情况下，分别测定其吸光度。 （3）以标准溶液浓度为横坐标（不必考虑显色剂等引起的浓度变化），以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C关系图。 （4）在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。 如Folin酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质含量 取14只试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL标准蛋白质溶液(250 g/mL)，用水补足到1mL，加入5mL试剂甲，混匀，于2025放置10分