加味四君子汤对小鼠肠道免疫功能调整作用的研究

1、加味四君子汤对小鼠肠道免疫功能调整作用的研究【摘要】目的观察加味四君子汤和思密达对小鼠肠道免疫功能的调整作用。方法盐酸林可霉素灌胃建立小鼠肠道菌群失调及免疫功能紊乱模型。昆明种鼠随机分6组，正常对照组、自然恢复组、造模组、思密达组、加味四君子汤组和两药合用组，分别进展肠道菌群检测、小肠黏液中sIgA的测定、血清中IL-2的测定及肠通透性(尿液中乳果糖与甘露醇比值)的检测。结果盐酸林可霉素灌胃3d小鼠，肠道菌群失调，sIgA从正常对照组的14.54g/l增加到18.70g/l，IL-2从正常对照组的1186.65g/l降低到1111.58g/l、L/从正常对照组的1.27增加到1.37g/l。实

2、验组分别给加味四君子汤、思密达及两药合用后，肠道菌群得以调整，sIgA含量从18.70g/l降低到14.52g/l，IL-2的含量从1111.58g/l增加到1189.58g/l，肠黏膜通透性减校各治疗组间比拟，加味四君子汤和思密达合用组优于加味四君子汤组和思密达组。结论加味四君子汤和思密达均能修复受损黏膜，有调节肠道免疫功能的作用，但加味四君子汤在调整失调的菌群方面优于思密达，两药合用给药那么能起到最正确效果。【关键词】肠道菌群；加味四君子汤；肠道免疫；肠通透性正常肠道屏障功能依赖于肠黏膜上皮屏障、肠道免疫系统以及肠道的正常微生物的平衡1。近年来，很多学者开场研究四君子汤对肠道菌群的调整作用

3、，鞠宝玲、李俭等2，3研究说明四君子汤可以改善脾虚大鼠胃肠黏膜的异常形态，使其恢复正常，并对双歧杆菌和乳酸杆菌有明显的增菌作用，从而调节肠道菌群失调，治疗由肠道菌群失调导致的一系列疾病，李莉等4研究了加味四君子汤对肠道菌群失调小鼠的调整作用，效果显著。本文讨论山药参加四君子汤对肠道菌群的调整及机体免疫功能的调整作用。1材料与仪器1.2药物与试剂盐酸林可霉素300g/L,上海旭东海普药业，批号：070509；思密达，博福-益普生制药，批号：S0293；中药：人参、山药、白术、茯苓、甘草，购于张仲景大药房，将上述中药按22221混合，水提取，过滤浓缩至1g/l生药量；生理盐水，山东鲁抗辰欣药业；乳

4、果糖辽宁省丹东市康复制药厂；甘露醇北京化工厂，进口分装；甲基甘露糖苷SIGA；吡啶FLUKA；羟基盐酸盐SIGA；n-三甲基硅烷咪唑SIGA1.4仪器设备酶标仪(BI-RADdel680)；气相色谱FULIG9790II配有FID检测器，微机色谱数据处理系统SE-54，150.530.5毛细管柱。色谱分析条件：SE-54，150.53毛细管柱。初温150，程序升温I终温220，速率10/in,程序升温II终温280，速率15/in，保持6in,注样器的温度220，检测温度300。载气高纯氮30l/in,燃气氢气30l/in，助燃空气300l/in。2方法2.1动物分组、造模3及给药方法昆明种小

5、鼠72只，体质量1822g，雌雄各半。随机取出12只作为正常对照组，其余用盐酸林可霉素300g/l灌胃，每次0.3l，2次/d，连续3d，正常对照组灌等量生理盐水。随机取出12只作为模型组，立即处死，进展各种指标检测。然后将剩余的48只随机分为4组，分别灌以生理盐水、思密达、加味四君子汤、及两药合用。中药组和生理盐水组，0.3l/次，2次/d，连续6d；思密达组0.06g/l，0.2l/次，2次/d，连续10d。各治疗组及正常对照组给药完成后处死小鼠，采集标本进展各种指标检测。2.2肠道菌群检测无菌采取小鼠鲜粪便约0.2g置于灭菌后带玻璃珠的青霉素小瓶，加灭菌生理盐水制成10倍的稀释度，振荡使

6、之均质化，递10倍稀释至10-6，取25l分别接种在各类选择性培养基上，培养EB培养基及E培养基放入需氧环境35培养1624h后计数，BLb培养基、LBS培养基和BD培养基放入厌氧环境35培养4872h之后计数6。根据菌落形态，涂片分析及耐氧实验结果计算各菌群每克粪便中菌落形成单位FU/g。2.3小肠粘液sIgA测定取紧靠回盲部小肠肠段4，平铺于滤纸上，纵向剖开刮取肠道内容物及粘液于EP管中，参加1lPBS充分匀浆，4000r/in，30in，取上清，按ELISA试剂盒说明书进展粘液sIgA的测定，在450n处读取相应的A值。2.4IL-2测定搜集眶后血管丛血液置于Eppdeffer管，37温

7、箱中放置1h，4000r/in离心，取血清置于-80冰箱中保存，按试剂盒说明书进展血清IL-2的测定。2.5L/的测定5，7将乳果糖200g，甘露醇100g参加10l生理盐水中配成混合溶液，以0.5l/只剂量灌胃。搜集服糖后6h尿液，置-20冷冻保存备用。取待测尿样100l参加试管内，然后加125l内标液，在充氮气容器内枯燥，再加100l肟溶液1l吡啶中参加25g羟基盐酸盐7530in，再加100ln-三甲基硅烷咪唑7515in，冷后取2l进展色谱分析。转贴于论文联盟.ll.3结果3.1肠道菌群的定量检测见表1。小鼠经盐酸林可霉素灌胃后，与正常对照组相比，5种肠道菌群发生显著变化，其中双歧杆菌

8、、乳酸杆菌、肠杆菌数量显著降低，而肠球菌、类杆菌数量有所升高。经各组治疗后，各种细菌根本恢复到正常程度，其中加味四君子汤组效果最好，与正常对照组已无差异P0.05。表1小鼠经盐酸林可霉素灌胃和药物处理后肠群检测结果(略)3.2sIgA和IL-2的测定结果见表2。小鼠经盐酸林可霉素灌胃后，sIgA增高，IL-2降低，经加味四君子汤和思密达治疗后，sIgA和IL-2的含量趋于恢复到正常程度，其中以加味四君子汤和思密达组恢复的最好。3.3尿液中L/的测定正常对照组的小鼠尿液中L/的峰面积比值为1.2754494.881269.08/42973.021266.39。结果见图1，而灌胃3d盐酸林可霉素后

9、，L/的峰面积值升高到1.3758894.8831627.90/42988.966741.20。见图2。表2小鼠经盐酸林可霉素灌胃和药物处理后小肠黏液sIgA和血清IL-2含量测定结果(略)4讨论乳果糖通过小肠黏膜上皮细胞的严密连接处吸收，乳果糖的吸收与小肠黏膜上皮细胞的严密连接完好程度成反比；甘露醇通过小肠上皮细胞膜上的水溶性微孔吸收。两者在小肠内不代谢，直接吸收入血，然后由尿中排出，可从尿中进展定量测定其吸收量。假如尿中L/的值升高，即说明上皮细胞间的构造已发生改变，黏膜的通透性增加。本文结果说明，小鼠经盐酸林可霉素灌胃后，L/值增高，黏膜有损。经加味四君子汤和思密达治疗后，L/值又降低到

10、正常程度，黏膜的通透性降低。黏膜通透性降低说明破损的黏膜已经根本得到修复，这与肠道菌群的调整也有很多关系。近年来，国外学者7采用多种糖来检测胃肠道黏膜的通透性，其中比拟常见的为三氯蔗糖，它可以全面反映胃肠道的通透性，对于其在本实验中的应用还有待于进一步研究。IL-2是参与免疫应答的重要细胞因子，并参与炎症反响。sIgA参与机体部分免疫，在呼吸道、消化道黏膜防御机制中发挥重要作用8。梁庆红等9用卡那霉素50g小鼠灌胃，连续10d，建立了小鼠肠道菌群失调模型，观察到血清IL-2、IL-3的含量低于对照组。刘崇海等10给小鼠口服头孢哌酮7d后经口给予白色念珠菌，诱导肠道菌群失调，检测脾指数、PHA诱

11、导的淋巴细胞转化率、迟发型变态反响、抗体生成细胞数和脾脏的TLR2和TLR4基因表达程度均低于对照组。石梅等11用盐酸林可霉素、头抱哇林钠及氨节西林钠混合液各药浓度均为100g/l小鼠灌胃，0.2l/只，2次/d，连续3d，小鼠肠道菌群失调后导致其免疫器官指数,血清免疫球蛋白IgA，Ig，IgG含量,淋巴细胞转化率和单核一巨噬细胞吞噬率均极显著下降。这些研究说明，菌群紊乱可引起机体免疫功能低下或紊乱。本文结果说明，经盐酸林可霉素灌胃后，小鼠血清IL-2含量降低，与上述结果一致；小肠黏液sIgA含量增高，可能与本文抗菌药用量相对低和时间短，紊乱菌群刺激肠道部分黏膜免疫系统，sIgA分泌量增加有关

12、。本实验应用盐酸林可霉素造成小鼠肠道菌群失调，其中肠道有益菌双歧杆菌和乳酸杆菌，及肠杆菌数量下降，而类杆菌和肠球菌数量升高。小肠黏液中sIgA的含量增高，血清中IL-2含量降低，尿液中L/的比值增高，这些变化均显示小鼠肠道的部分屏障功能和全身免疫功能紊乱。经加味四君子汤调整后，肠道菌群根本恢复正常；思密达组对肠道菌群的调整作用效果不明显，但对肠黏膜的修复效果较好。加味四君子汤和思密达合用组无论是在对肠道菌群的调整方面，还是在调整肠道免疫功能方面都有较好的效果。这提示在应用抗菌药物的同时，可适当加服一些能对肠道菌群有调整作用和对肠道免疫功能有调整作用的制剂，预防内源性感染。【参考文献】1Heht

13、G.Innateehanisesfepithelialhstdefense;sptlightnintestineJ.AJPhysil,1999,277:351.2鞠宝玲，陆叶，唐小云，等.四君子汤及其纳米制剂对微生态失调小鼠的调整作用J.中国微生态学杂志，2022，19(1):6.3李俭，王琳，杨景云，等.四君子汤对免疫抑制小鼠肝脏细菌易位的影响J.中国微生态杂志，2022，172：102.4李莉，白晓玲.加味四君子汤对失调小鼠肠道菌群的调整作用J.中华临床医学研究杂志，2022，137：850.5祝小枫，熊德鑫，盛志勇，等.肠通透性改变的检测，第1版J.解放军医学杂志，1997，222：150.6罗予，冯羡菊.临床厌氧菌检测及图解.北京：中国协和医科大学出版社，2022：74.7AshkanFarhadi,AliKeshavarzian,JereyZ.Fields,alihaShEikh,AliBanan.ReslutinfndietarysugarsfrprbesugarsfrtestfintestinalpereabilityusingapillarylungashratgraphyJ.JurnalfhratgraphyB,2022，83612：63.8BulbergRS,Strber.PrspetsfrresearhininflaatinbldiseaseJ.JA