Zn2+和金属硫蛋白在细胞内表达的关系

1、Zn2+和金属硫蛋白在细胞内表示关系第1页MRE：金属反应元件MT ：金属硫蛋白apo-MT:金属硫蛋白前体物SH ：巯基NLS：核定位序列PKC：蛋白激酶CMTF-1 :金属转录因子apo-MTF-1:无活性金属转录因子JNK：c-Jun氮端激酶-TGCRCNC-：MRE关键区域共有序列主要英文缩写符号说明第2页序言MT结构Zn2+和MT在细胞内表示Zn2+介导MT在细胞内表示机制 结语参考文件汇报内容第3页一序言第4页全部组织和细胞大脑神经元和神经胶质复层鳞状上皮细胞功效特异性MT-1,MT-2MT-3MT-4抵抗金属离子毒性和氧化应激参加神经细胞生存以及轴突形成表示角质素，促进上皮细胞角

2、质化参考文件： Andrews，1990； Toriumi等, ；Quaife等，1994 1957年Margoshes,Vallee首次在马肾脏中发觉MT ，到当前为止共发觉170各种MT分子，包含MT-1MT-4四种基因类型。 （Sundar等，）第5页研究对象研究内容资料起源鼠MT能够维持细胞内锌离子稳态Cousins，1985小鼠日粮中锌缺乏和过量均会引发机体MT表示Kelly等，1996转基因小鼠会大量表示MT-1抑制日粮中锌缺乏Dalton,1996饲喂锌缺乏日粮会影响老鼠胰脏MT浓度和其mRNA水平Palmitre等，1996Zn2+MT在细胞内表示 锌是动物必需一个微量元素，它

3、能与DNA或者其它蛋白质相互作用，在全部锌依赖酶和组织蛋白中发挥主要催化和结构功效（Gaither等，）.第6页二MT结构第7页MT普通是由60一68个氨基酸残基组成多肽单链分子中含有大量巯基，但不存在二硫键，在自然条件下，全部巯基均与金属离子结合（Binz等，1999） 分子量少于10，000Da；含有4-12个金属离子分子；有丰富CysXCys序列结构域；缺乏芳香族氨基酸，组氨酸含量极少（资料起源：Meloni等，）图1 老鼠四种MT亚型氨基酸序列MT一级结构第8页MT空间结构（资料起源：Maret等，)图2 F/R探针MT三维结构1MT整个分子呈哑铃形。由和两个大小相近球形结构域组成。2

4、两个结构域经过第30，31位残基(铰链区)相连。第9页MT分子中没有-螺旋和-折叠肽段，一分子MT能够结合7个Zn或Cd(Michalska等，1996）。在MT分子中，每三个硫基与一个金属离子形成复合物（Hamor ，1986)。图3 老鼠MT-2分子三维结构模型图（资料起源：Vasak， )图4 脊椎动物和酵母中两种金属硫醇盐簇形式S第10页 三、Zn2+和MT在细胞内表示第11页研究对象研究内容研究结果资料起源鼠肾小管上皮细胞Zn2+刺激肾小管上皮细胞Harford ，1991肝细胞Zn2+诱导老鼠肝细胞Hidalgo，1990神经瘤细胞Zn2+刺激老鼠神经瘤细胞Ebadi， 1988人

5、红细胞Zn2+刺激人红细胞中MT含量改变Sullivan等，1998单核细胞Zn2+诱导人单核细胞Mesna ，1990；Sullivan等， 1998外源性诱导细胞内锌浓度升高是否也会引发MT表示呢？MTmRNA在老鼠肝脏，肠道，肾脏表示受到Zn2+调整。 （Blalock,1988)3.1 外源性添加锌诱导MT表示第12页（资料起源：Jayasurya等,）图6 细胞核中锌浓度与MT在细胞中表示关系（资料起源：Tang等，）图5 MT维持胞内Zn2+稳态模拟图MT是胞内数量最多锌结合蛋白,对Zn2+有很高亲和性，Zn-MT在基因表示和信号传递等过程中发挥主要作用（Satoh,等 1999)

6、。说明细胞中Zn2+浓度升高能够引发MT表示。3.2 外源性诱导胞内Zn2+浓度升高引发MT表示第13页研究表明：细胞中加入外源性诱导剂，如NO,H2O2，重金属离子也会引发MT表示，而这种诱导都是经过释放MT中Zn2+实现。这几个外源性诱导剂诱导细胞内Zn2+浓度升高，其作用方式是否相同？第14页图8 外源性NO供体提供NO与Zn2+均引发MT-1,MT-2mRNA表示（资料起源：Spahl，）Zn2+NONOZn2+图7 iNOS衍生NO引发鼠动脉上皮细胞中MT-1,MT-2mRNA表示MT-1MT-23.2.1 NO诱导MT中Zn2+释放引发MT表示表明内源性和外源性NO均能够诱导细胞内

7、MT表示。第15页（资料起源：Kroncke, 1994)图9 NO诱导马肾上皮细胞MT中Zn2+释放伴伴随巯基降低Zn-MT结构是半胱氨酸配基诱导MT氧化还原反应化学基础（Maret,1998）表明NO破坏了Zn-S结构，使Zn2+从MT中释放出来进入胞质中。第16页图10 G75凝胶色谱仪分析老鼠肝脏上皮细胞胞质溶胶中加入Zn2+以及Zn2+DETA/NO后MT中Zn2+改变(资料起源：Katakai等，)表明：NO置换了MT中Zn2+，引发其中Zn2+释放进入细胞质。？其它物质诱导MT表示是否也是经过释放MT中锌实现呢？第17页图11 H2O2诱导人色素上皮细胞MT表示（资料起源：Tat

8、e等， 1995)3.2.2 H2O2诱导MT中Zn2+释放引发MT表示细胞中MT以不含有Zn2+apo-MT形式存在时，H2O2不能诱导MT基因表示（Zhang等，）。说明H2O2诱导MT表示对Zn2+可能含有依赖性。第18页图13 胞内铜浓度改变对MT-1mRNA水平影响（资料起源：Mcardle等， 1990)说明Cu2+,Cd2+诱导MT在胞内表示可能和Zn2+相关。3.2.3 重金属离子诱导MT中Zn2+引发MT表示研究发觉，使用apo-MT处理过量Cu2+和Cd2+时，均不能诱导细胞中MT-1基因表示(Zhang等，） 。第19页表明Cu2+,Cd2+诱导MT表示，也是经过置换其中

9、Zn2+引发。（资料起源：Chiaverini，)图14 老鼠肝脏Cd2+,Zn2+-MT-2三维结构ZnCd哺乳动物MT主要结合胞内Zn2+（Kagi ，1991），在Cu2+和Cd2+过载情况下，Zn2+能够被很轻易取代（Shaw等， 1991）。第20页细胞中Zn2+是怎样诱导MT在胞内表示呢？以上研究表明：细胞中直接添加Zn2+或外源性诱导剂NOH2O2和重金属离子均能够释放MT上Zn2+，诱导MT本身表示，所以Zn2+是MT表示一个必需成份。第21页四、Zn2+介导MT在细胞内表示机制第22页MTF-1是结合在MREs功效区域发挥其作用（Koizumi，1999）图15 MRE存在于

10、MTF-1调整基因临近开启子序列上（资料起源：Andrews，）MTF-1是Cys2-His2家族一个锌指转录因子（Radtke，1993），也是基础条件和重金属诱导下，MT表示所必需（Heuchel等，1994）MRE是一个12bp短序列，它是MTF-1在DNA序列上一个结合点，金属离子应答性反应依赖于MRE序列（Cizewski等，1989）。第23页（资料起源：Smirnova, ）图16 蛋白质印迹和电泳分析Zn2+处理后，MTF-1在细胞核蓄积和其活性形式改变4.1 Zn2+和MTF-1在胞质中激活说明，Zn2+引发了MTF-1在细胞质中激活过程，而且其激活过程是发生在MTF-1从细

11、胞质向细胞核核转运过程中。第24页图17 老鼠体内MTF-1激活仅仅是Zn2+作用(资料起源：Bittel等， 1998）图18 人胚肾细胞中，Zn7-MT存在， 促进MTF-1激活（资料起源：Zhang等，）MTF-1表明MTF-1在胞内激活过程是由Zn2+引发，其它金属离子诱导细胞质中MTF-1激活也是依赖于其中Zn2+作用。？那么，Zn2+是怎样激活MTF-1呢？第25页老鼠MTF-1蛋白由675个氨基酸组成，包含一个含有6个Cys2-His2锌指DNA结合区域（图b)和三个转录激活区域(图c)（Radtke等，1993），以及假定核定位序列（NLS）和核输出序列（NES)(图a,c)(

12、Saydam，) （资料起源：Laity等，)图19 老鼠MTF-1蛋白主要区域结构MTF-1区域结构第26页图20 MTF-1锌指无序性（资料起源：Potter等， ）这说明锌指F1-F6可能含有不一样功效性质。Chen（1998）CD分析MTF-1F1-F6锌指结构发觉其在222nm处含有相同A值，而与Zn2+在其锌指半胱氨酸上结合位置无关！第27页图21 MTF-1锌指缺失后与DNA结合活性（资料起源：Bittel等，）图22 缺失F1,F5,6后，MTF-1在酵母上功效活性研究表明：存在两种锌依赖激活MTF-1现象。现象1：MTF-1激活主要依赖于锌指F1,而不是F5,F6。第28页图

13、24 缺失锌指F1，F5-6， MTF-1,短暂转染果蝇SL2细胞后功效（资料起源： Bittel等，）图23 缺失锌指F1，F5-6 MTF-1,短暂转染老鼠纤维母细胞（MTF-1-/-)后功效说明锌指F1可能作为激活细胞质中apo-MTF-1一个功效锌指，而锌指F5,F6则是作为MTF-1结构锌指，参加MTF-1结构组成。第29页资料起源：（Apuy等， ）图26 烷基化处理F1-F6中各个巯基后，各锌 指中半胱氨酸残基反应活性比率图25 SDS分析MREd存在下，胰蛋白酶处 理Zn6-MTF-1zf随时间改变(资料起源：Chen等， 1999)现象2：MTF-1激活主要依赖于锌指F5,F

14、6,而不是F1。说明MTF-1锌指F5,F6对锌亲和能力要强于锌指F1-F4.所以F5,F6可能是作为MTF-1功效锌指，而F1-F4是作为结构锌指。第30页（资料起源：Chen等，1998）模型A：Zn2+结合在弱Zn2+结合区域（F5,F6),造成分子内变构激活MTF-1。模型B：Zn2+与F1可逆结合，消除妨碍F2-F4与F6相互作用影响原因造成MTF-1激活。图27：Zn2+激活MTF-1两种模型：Zn2+激活MTF-1两种模型：第31页（资料起源：Stitt等，)图29 MT敲出型小鼠肺上皮细胞中MTF-1核转运数量降低（资料起源：Saydam等，）图28 MTF-1核转运有时间和浓

15、度依赖性Zn2+能够加速MTF-1向细胞核转运过程（Smirnova，） ？说明： Zn2+引发了MTF-1核定位过程。4.2 Zn2+和MTF-1核定位第32页（资料起源：Saydam等，)图31 Zn2+诱导NLS突变体MTF-1向细胞核内运输被推迟图30 人MTF-1中NES和NLS序列（资料起源：Saydam,）F1第33页图32 老鼠纤维母细胞锌处理MTF-1锌指F1缺失之后核质MTF-1改变（资料起源： Bittel等，）表明：锌指F1单独存在可能并不影响MTF-1核定位，MTF-1核定位过程可能还依赖于其分子上其它功效区域作用。Bitter()研究发觉，MTF-1中锌指F1对于M

16、TF-1与DNA结合活性有很主要作用，而不是F2-F6作用。第34页图33 人MTF-1锌指F1-F3足够引发丙酮酸激酶（myc-pk)核定位（资料起源：Lindert等，）表明：丙酮酸激酶（myc-pk)核定位是依赖于MTF-1上面NLS序列以及其锌指F1-F3共同作用。第35页图34 人MTF-1氨基酸133-226序列是其核定位必须（资料起源：Lindert等，）表明：人MTF-1氨基酸133-226序列是其核定位必须，所以，MTF-1上NLS序列和其锌指F1-F3一起作为MTF-1核定位新功效序列SNAIL1。第36页资料起源：（Saydam， ）图35 各种应激处理MTF-1转录激活

17、4.3 Zn2+和MTF-1磷酸化？说明：MTF-1核定位还不足以引发老鼠MT基因转录发生。可能还存在其它方式影响了MTF-1激活过程。第37页MTF-1活性可能和其磷酸化相关（Bittel，1998），其磷酸化发生在核转运过程中（Saydam，)，Zn2+能够诱导MTF-1磷酸化（Adams，）资料起源：（LaRochelle，）图36 MTF-1在猴肾脏细胞中磷酸化第38页（资料起源：Saydam，）图37 MTF-1在人肾脏细胞中磷酸化图38 MTF-1在人胚肾细胞和老鼠肾细胞中磷酸化（资料起源：Adams等， ）说明：Zn2+诱导了MTF-1结构中丝氨酸和苏氨酸富集区域磷酸化，而且，细

18、胞质中存在一定量磷酸化MTF-1，Zn2+加入，诱导了更多MTF-1磷酸化。MTF-1磷酸化与Zn2+诱导MT-1表示有什么关系？第39页图39 金属离子激活老鼠L细胞JNK和PKC说明：Zn2+是经过激活PKC,PI3K,JNK三种激酶活性，最终引发MT-1基因表示。 图40 PKC,PI3K,JNK酶抑制剂处理老鼠L细胞中MT-1mRNA分析（资料起源：LaRochelle，）PKCJNK第40页(资料起源：Saydam等，）图41 PKC抑制剂对Zn2+诱导MT转录影响说明：PKC抑制剂能够抑制Zn2+诱导下，MT-1和MRE表示，不过不抑制MT-1和MRE在细胞质中基础水平表示。第41

19、页表明：MTF-1磷酸化是MT表示所必须，其可能与Zn2+诱导MT-1表示过程中PKC,JNK等几个酶激活相关，而Zn2+是经过刺激MTF-1信号转导路径中这几个激酶，最终引发MT基因表示。图43 PKC抑制剂对MTF-1与DNA结合活性影响（资料起源：Adams等 ，）资料起源：（LaRochelle ，）图42 PKC,JNK等酶缺乏突变体小鼠抑制金属离子诱导MT质粒MRE表示第42页（资料起源： Saydam等，）图45：PKC抑制剂对老鼠肾脏细胞中MTF-1磷酸化水平影响图44：PKC抑制剂对老鼠肾脏细胞中MTF-1磷酸化水平影响（资料起源：Adams等，）说明：Zn2+激活MT基因转

20、录可能是受到去磷酸化MTF-1调整。可能原因是，Zn2+诱导磷酸化MTF-1进入细胞核，而特异残基去磷酸化，最终激活MT基因转录。第43页六结语第44页1.外源性添加Zn2+能够诱导细胞内MT表示。2.外源性诱导剂NO，H2O2以及重金属离子诱导MT在细 胞内表示依赖于MT中Zn2+作用。3.Zn2+诱导MT在细胞内表示分为三个过程： 第一，Zn2+与MTF-1锌指结合；第二，Zn2+经过PKC等 几个酶诱导MTF-1磷酸化；第三，Zn2+介导活性 MTF-1进入细胞核，最终活性MTF-1与MRE结合，开启 MT转录发生。第45页七，参考文件第46页Aravindakumar,C.T.,Ceu

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