基因工程制药思考题补充版

1、一、基因工程药物上游表达系统重点1、大肠杆菌表达系统与酵母表达系统的异同（指出至少四点）相同点：易操作、繁殖快、成本低廉、易于工业化生产不同点：mRNA在真核中有PolyA尾巴，而在大肠杆菌中没有大肠杆菌表达系统转录信号与酵母表达系统不同，与核糖体的结合位点不同。3在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰作用，故对蛋白质产物不能糖基化，而且大多数无法正确折叠；酵母菌具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统。大肠杆菌表达系统由于分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性，且对于大肠杆菌来说，外源基因及其表达的蛋白都是外来物，对其有降

2、解的趋势；酵母菌具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低、包涵体变性复性等问题。大肠杆菌中的表达不存在信号肽，故产品多为胞内产物，提取时需破碎细胞，此时细胞质内其他蛋白也释放出来，因而造成提取困难；酵母菌能将外源基因表达产物分泌至培养基。2、动物细胞表达系统与昆虫表达系统的异同（指出至少四点）相同点：动物细胞表达系统能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的0型糖基化等多种翻译后加工功能,昆虫表达系统也可进行翻译后加工修饰。2哺乳动物细胞表达载体的必要元件包括：一个高活性的启动子、转录终止序列和一个有效的mRNA翻译信号，而利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表

3、达外源蛋白也需要强启动子。不同点：1由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生的外源蛋白质，在活性方面远胜于昆虫细胞表达系统，更接近于天然蛋白质。昆虫细胞的培养最适培养温度是27-28r，不需要CO2,这与哺乳动物细胞的培养是不同的。3动物细胞除少数悬浮培养细胞外，大多数正常的二倍体细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制或密度抑制现象；昆虫细胞既可以贴壁生长，又可以悬浮生长。与哺乳动物细胞的生长不同，昆虫细胞产生乳酸这一动物细胞主要代谢副产物的量很低，同时对另一副产物氨的耐受力较好，这意味着昆虫细胞的培养较哺乳动物细胞容易，因此昆虫细胞的培养多采用补料分批培养而不是灌注培养。3、从工业化生产的角度，分析大

4、肠杆菌表达系统、酵母表达系统昆虫表达系统和动物细胞表达系统的优缺点。大肠杆菌（E.coLi）表达体系优点：1、与其它生物相比，基因简单，遗传背景清楚2、繁殖速度快，平均20min代3、培养方法简单，成本低4、相对其它生物对人体而言，安全性高5、表达载体多，构建方便缺点：1、由于基因结构上的差别，会出现密码子偏好转录信号与真核不同，与核糖体的结合位点不同，不通用，即SD序列。表达的蛋白缺乏翻译后修饰，如没有糖基；而且大多数无法正确折叠mRNA在真核中有PolyA尾巴，而在大肠杆菌中没有只能表达cDNA，而内含子的作用没有体现对于大肠杆菌来说，外源基因及其表达的蛋白都是外来物，对其有降解的趋势酵母

5、表达系统优点：1、全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便2、具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉3、能将外源基因表达产物分泌至培养基4、不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统5、酵母菌是最简单的真核模式生物缺点：酵母表达系统也有其局限性。由于表达的外源蛋白的聚合体存在而影响产率；由于信号肽加工不完全、内部降解等因素造成表达产物结构上有差异的现象，即表达产物不均一现象，为酵母表达基因工程产物的纯化和工业化生产带来了困难。昆虫表达系统：具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的

6、能力。利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式，其表达的蛋白水平高达1500mg/L，但受到诸多因素的限制和影响，如培养基质量、供氧情况、保证对数生长等。杆状病毒系统的主要特点包括重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配；蛋白翻译后的加工修饰；表达水平高，可达总蛋白量的50%；可容纳大分子的插入片段；能同时表达多个基因。主要缺点是外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下，这时由于病毒感染，细胞开始死亡。动物表达系统：哺乳动物表达系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，适合表达完整的大分子蛋白。由哺乳动物细胞翻译后再加工修饰产生

7、的外源蛋白质，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统，更接近于天然蛋白质，但构成复杂、操作技术要求高、表达产量不大、产率低，生产成本高，且有时会导致病毒感染等是该表达系统的不足之处。4、一个表达载体必备的元件有哪些。1、有一个强的原核启动子及其两侧的调控序列；2、应有SD序列，而且SD序列与起始密码子ATG之间要有合适地距离；3、在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；4、外源基因下游应加入不依赖于p因子的转录终止区等。5、如果需要表达一个蛋白，要从哪几方面来考虑和设计从而选定适当的表达系统。表达系统选择的根据是研究和开发的目的。具体考虑以下几个方面：1、目的基因的来源，如

8、果是大肠杆菌来源的基因，选择大肠杆菌作为表达系统较好，这主要是考虑到与目的基因来源相同的宿主对于保证蛋白的活性较有利且基因遗传密码的偏爱性较一致。2、生产的成本和工艺放大要求。大肠杆菌和毕赤酵母系统生产重组蛋白的成本低，生产工艺较简单，用于规模化生产较有利。如果是研究需要小量蛋白，主要考虑目的蛋白的活性和小规模纯化制备的方便。3、研究周期和可操作性。在这一点上，大肠杆菌优于酵母，酵母优于细胞。4、蛋白的用途和用量。对于药品开发，原核表达系统、真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统都可以选择，但要考虑到报批的要求。如果是体内用，天然的氨基酸序列较重要，最好不要因为基因表达和蛋白纯化的便利引入融合伴侣

9、，如果是制备抗原用于纯化和体外的活性研究则不必太严格。某些蛋白体内活性需要的剂量并不大，ngiostatin,但是，大肠杆菌或酵母表达的蛋白体内半衰期短，所以蛋白用量较大。、蛋白的天然性质。如果目的蛋白本身是分泌蛋白，则选择分泌表达较好，毕赤酵母分泌表达优势非常显著。对于大肠杆菌系统来说，其蛋白的分泌机制复杂，除了信号肽之外，有些蛋白的分泌和与成熟蛋白的序列有关，而且大肠杆菌的分泌很难进入培养基，通常是在周质空间积累。根据蛋白活性的要求，结合其天然的性质，选择表达系统是非常重要的。、知识产权的考虑。如果是研究工作，选择商品化的载体较好。如果是开发工作，选择表达系统时最好是把载体的知识产权问题考

10、虑进去，否则可能会受制于人。总之，选择一种合适的表达系统是开始基因表达工作前的重要步骤，选择的主要依据是研究的目的，结合各种其他参数的综合考虑。6、名词解释：1、基因工程药物基因工程药物是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，经过一系列基因操作，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中去，这些受体细胞包括细菌、酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细胞，在受体细胞不断繁殖过程中，大规模生产具有预防和治疗这些疾病的蛋白质，即基因疫苗或药物。2、基因药物基因药物是以基因组学研究中发现的功能性基因或基因的产物为起始材料，通过生物学、分子生物学或生物化学、生物工

11、程等相应技术制成，并以相应分析技术控制中间产物和成品质量的生物活性物质产品，临床上可用于某些疾病的治疗、预防和诊断性治疗。3、生化药物生化药物一般是系指从动物、植物及微生物提取的，亦可用生物-化学半合成或用现代生物技术制得的生命基本物质，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、辅酶、多糖、核苷酸、脂和生物胺等，以及其衍生物、降解物及大分子的结构修饰物等。4、基因治疗基因治疗是在了解发生疾病的基因位置、结构、功能及其调控机制的前提下，使用个性化的、靶向明确的基因药物等，对致病基因进行修补、置换或调节，从根本上纠正缺陷的基因，恢复健康。5、穿梭载体穿梭载体(shuttlevector)是指含有两个亲缘关系不同

12、的复制子，能在两种不同的生物中复制的。这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点.通常穿梭载体在细菌中用于克隆，扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析.6、质粒细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。7、启动子DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。8、抗性基因一类能阻止抗生素作

13、用的基因或营养补偿性基因。如某些氨基酸合成酶基因等。这些基因的表达能赋予生物抵抗药物等毒害或营养缺陷的环境，常用做选择性遗传标志。9、融合蛋白通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组，将其表达后获得的新蛋白质。10、纯化标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等11、嵌合型抗体利用DNA重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合的抗体。12、稳定表达外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。重组基因的稳定表达水平一般要比短暂表达低12个数量

14、级。(2)基因工程表达系统中工程菌株或细胞虽经过多次传代或条件变化，但表达水平仍然保持稳定的现象。13、瞬时表达瞬时表达，即瞬时转染后的初期，质粒或DNA片段是游离在细胞中的，能够进行表达，成为瞬时转染表达。二、发酵部分思考题一、预计为填空题（小字部分）1、发酵工程发展史上的几个转折点第一个转折点：非食品工业，第二个转折点：青霉素一抗菌素发酵工业第三个转折点：代谢控制发酵。切断支路代谢:酶的活力调控,酶的合成调控（反馈控制和反馈阻遏）,解除菌体自身的反馈调节,突变株的应用,前体、终产物、副产物等近代转折点：基因、动物、海洋2、获得新型菌种的方法有哪些a、自然选育b、诱变选育c、杂交育种d、原生

15、质体融合技术（细胞融合技术）e、基因工程技术3、常用的菌种保存方法有哪些a、斜面4C保藏（平板）b、砂土管保藏c、甘油管法d、真空冷冻干燥法e、液氮超低温保存法f、质粒的保存4、筛选基因工程菌高表达菌株需要进行哪些鉴定工作a、构建前：目的基因的来源、克隆、鉴定质粒的来源、结构宿主菌的来源和特点b、构建完成后：目的基因的测序（酶切和PCR鉴定）表达鉴定，产物鉴定c、稳定性鉴定：结构不稳定性分离不稳定性5、微生物培养基中一般包含哪些成分，各自的功能是什么？a、碳源：构成细胞成分（需要量最大的元素，50%）；形成代谢产物；形成储藏物；为异养型微生物提供能源b、氮源：主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，

16、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：1、有机氮源：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子2、无机氮源：满足菌体生长、稳定和调节发酵过程中的pHc、无机盐和微量元素：磷、镁、硫、铁、钾、钠、钙构成细胞的组成成分；作为酶的活性中心；维持酶的活性；调节细胞渗透压，氢离子浓度和氧化还原电位；作为某些自养菌的能源。d、水（1）营养物质或代谢废物运输的必备物质；（2）直接作为反应物或产物参与体内多种生化反应；（3）水还是许多有机物中氢和氧的来源，例如烷烃分解过程；（4）许多酶促反应必须在水溶液中才能进行；（5）水是热的良导体，有利于散热，不致于因代谢产热而使细胞局部温度上

17、升；（6）作为活细胞中含量最高的成分，水对于维持细胞自身形状以及生物大分子的天然结构起着重要的作用。e、生长因子：从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌吟、嘧啶、维生素等均称生长因子。生长因子对发酵的调控起到重要的作用。（1）作为辅酶或辅基参与代谢；（2）核酸和蛋白质的成分。f、前体：在微生物的生物合成过程中，有些化合物能直接被微生物利用构成产物分子结构的一部分，而化合物本身的结构没有大的变化，这些物质称为前体。g、产物促进剂：指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。h、诱导剂：i、抗生素：6、什么是葡萄糖效应，葡萄糖效应对发酵有什么影

18、响葡萄糖效应又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用。葡萄糖或某些容易利用的碳源，其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。影响：Monod研究E.coli对混合碳源利用，发现葡萄糖抑制其它糖利用，出现二次生长。所有迅速代谢能源都能阻抑较慢代谢的能源所需酶的合成。酶的生成被易分解碳源所阻遏。如大肠埃希氏菌培养在含葡萄糖和乳糖的培养基上，在葡萄糖没有被利用完之前，乳糖操纵子就一直被阻遏，乳糖不能被利用，这是因为葡萄糖的分解物引起细胞内cAMP含量降低,启动子释放cAMP-CAP蛋白，RNA聚合酶不能与乳糖的启动基因结合，以至转录不能发生,直到葡萄糖被利用完后，乳糖操纵子才进行转录，形成利

19、用乳糖的酶，这种现象称葡萄糖效应。7、种子扩培的目的和要求，发酵用种子需要在哪几方面进行优化目的：接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间、保证生产水平要求：总量及浓度能满足要求生理状况稳定，个体与群体活力强，移种至发酵后，能够迅速生长无杂菌污染诱导条件的优化：诱导时间诱导剂浓度8、发酵级数：一般由菌体培养开始计算发酵级数，但有时工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。发酵级数确定的依据：级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响；级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级；在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面。9、温度对基因工程菌发酵的影响1温度直接影响着菌种的生长及产物

20、的形成一定范围内，温度上升，菌体成分与产物的生物合成速度上升；但过高时，则相反。2温度还会影响所产酶活力的稳定性3温度改变了发酵液的物理性质，间接影响着菌的生物合成温度除了直接影响发酵过程中各种反应速率外，还通过改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成。例如温度会影响基质和氧在发酵液中的溶氧和传递速率；会影响菌种对某些基质的分解吸收速度等。温度愈高，溶氧愈低。4温度还会影响生物合成的方向。5温度会影响产物的性质（包涵体）10、发酵过程中pH发生变化的原因1基质代谢，发酵过程中由于菌种在一定温度及通气条件下对培养基中碳、氮源等的利用，随着有机酸或氨基酸的积累，会使pH产生一定的变化。2产物形成

21、3菌体自溶，菌丝自溶阶段，随着基质的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中氨基酸增加致使pH上升4碳氮比，中间补料，生理酸性/碱性物质的存在等。11、pH对发酵的影响，如何在发酵过程中调节pH影响：1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用4）pH影响代谢方向pH的调节：1、调节好基础料的pH2、在基础料中加入维持pH的物质3、通过补料调节pH4、当补料与调pH发生矛盾

22、时，加酸碱调pH、预计为简答题（大字部分）1、如何提高发酵体系中的传氧速率，发酵过程中监控溶氧的意义提高溶解氧的方法：1、好气发酵的通气比（每分钟通入发酵罐的空气体积与液体培养基体积之比）通常为0.51.0。2、通过搅拌和在罐内设置挡板，来使气体分散，增加溶解氧浓度。3、空气分布器、液体的粘度也会影响溶氧。发酵过程中溶氧浓度监控的意义：1、溶氧作为发酵中氧是否足够的度量。好气性微生物深层培养时需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些代谢产物的合成。对多数发酵来说，氧的不足也会造成代谢异常，产量降低。2、溶氧可作为了解菌种对氧的利用规律。DO变化的情况最能看出菌种所在生产阶段对O2的供需规律及对生

23、产的影响。3、溶氧作为发酵异常情况的指示。当我们掌握了发酵中溶氧和其它参数之间的关系的正常规律。如发酵中溶氧变化异常，便可及时预告发酵可能发生的问题。4、溶氧作为发酵中间控制的手段之一。据报导，国外发酵业常通过DO值来控制补糖和流加的量。5、溶氧作为考查设备、工艺条件对氧供需与产物形成影响指标之一。为了提高发酵液中的溶氧水平不外从两方面着手：提高设备的供氧能力；改进与菌种需氧有关的工艺条件2、染菌原因的分析以及染菌对发酵的影响？染菌原因：设备渗漏、空气净化达不到要求、种子带菌、培养基灭菌不彻底、技术管理不善染菌对发酵的影响1、发酵染菌对不同品种的影响a、不同菌：放线菌由于生长的最适pH为7左右

24、，因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右，因此染酵母菌为多。b、不同产品：青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。2、污染不同种类和性质的微生物的影响a、污染噬菌体：噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产。b、污染其它杂菌：有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢

25、杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。3、不同时间染菌对发酵的影响a、种子培养期染菌b、发酵前期最易染菌，且危害最大c、发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。d、发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。4、发酵染菌对提炼和的影响a、对产品质量的影响，造成产品品质下降b、对提炼的影响，杂菌污染后改变发酵液的某些理化性质，致使提取困难3、发酵不同时期染菌情况的处

26、理（1）种子培养期染菌由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，而且培养液中几乎没有抗生素（产物）或只有很少抗生素（产物）。因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。（2）发酵前期染菌发酵前期最易染菌，且危害最大。原因：发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。措施：可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。（3）发酵中期染菌发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大

27、量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。措施：降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。（4）发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。4、泡沫对发酵的影响（正反两方面），如何消除泡沫益处：一定数量泡沫的存在可以增加气液接触面积，导致氧传递速率增加。危害：1、降低生

28、产能力：在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量2、引起原料浪费：如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。3、影响菌的呼吸：如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满二氧化碳而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸。4、引起染菌：由于泡沫增多而引起逃液，于是在排气管中粘上培养基，就会长菌。随着时间延长，杂菌会长入发酵罐而造成染菌。大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封，轴封处的润滑油可起点消泡作用，从轴封处落下的泡沫往往引起杂菌污染。如何消泡：1、机械消泡：机械消沫是依靠物理学的原理，即靠机械引起强烈振动或压力变化，促使泡沫破裂。2、消泡剂消泡：通过减

29、低液膜的机械强度或降低液膜的表面粘度使泡沫破裂。消泡剂可分为破泡剂和抑泡剂，破泡剂是加到已形成的泡沫中，使泡沫破灭的添加剂，如低级醇、天然油脂；抑泡剂是发泡前预先添加而阻止发泡的添加剂。5、发酵有几种模式，各自的优缺点分批发酵优点操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量容易掌握缺点产率低，不适于测定动力学数据分批补料发酵补碳源，能源，氮源，前体，水和无机盐中间补料的优点：推迟菌体自溶期，延长产物分泌期，维持较高的生产速率，增加发酵液总体积，使产量大幅度上升。现在大多数抗生素都采取补糖措施。缺点：使工艺复杂化，增加了染菌机会。因此工厂管理十分重要，一定要严格消毒。包括料液和管道消毒。连续

30、培养种类：（1）单级连续培养（2）多级连续培养优点：生产能力高，易于实现自动控制，生产率高缺点：培养浓度低，难以长期无菌操作。透析培养、灌注培养6、分批补料发酵中需要确定哪些条件和参数？1）碳源，能源2）氮源：主要作用是调节pH和补充所需N源，从而控制代谢活动。补料依据：氨基氮的消耗、菌的浓度、pH补氮控制：根据氮消耗速率、菌浓、发酵液粘度、pH决定补料时间和量；3）前体：前体确认试验、浓度确认试验、添加时间4）水和无机盐：当发酵液过于粘稠时补水可以稀释发酵液，增加氧的溶解度，提高供氧能力。有的抗生素发酵中采用带放措施，提高总产量8、大肠杆菌工程菌高密度高表达发酵常遇到的问题及其解决方法问题：

31、（1）不稳定性问题（2）诱导时机的把握（3）包涵体的形成（4）乙酸的形成减少不稳定性的措施：使用抗性选择调节pH降低生长和表达温度调整培养基流加速率，降低比生长速率,减少发酵生热分批诱导或流加诱导剂生物反应器改造使传质、传热速度高到能满足高密度发酵时的细胞的最大吸收能力。包涵体：措施上游：融合表达、分泌表达、和分子伴侣共表达等发酵工艺：降低温度、调节pH、分批诱导采用传质、传热效率高的生物反应器，防止乙酸等副产物产生，因为乙酸可能改变细胞质的pH,影响可溶性。减少乙酸积累的对策宿主菌培养基降低比生长速率降低培养温度透析培养限制性流加葡萄糖基因工程E.coli常用发酵模式最常用和最有效的方法就是

32、分批补料流加培养法。现在常用的是反馈补料培养。有几种反馈控制：控制基质浓度流加恒pH流加恒溶氧流加控制比生长速率的葡萄糖流加9、甲醇营养型酵母培养中的影响因素甲醇的浓度pH接种量微量量元素PTM1的影响蛋白酶硫酸铵10、动物细胞的几种培养方式，各自的优缺点1、贴壁培养贴壁培养的优点：容易更换培养液；细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。适用于所有类型细胞贴壁培养的缺点：与悬浮培养法相比扩大培养比较困

33、难，投资大；占地面积大不能有效监测细胞的生长2、微载体好处：可在反应器中提供大的比表面积可采用均匀悬浮培养，简化了各种环境因素的检测和控制，提高了培养系统的重演性可用普通显微镜观察细胞在微载体上的生长情况容易放大适合于多种贴壁依赖性细胞培养容易收获细胞。缺点：细胞生长在微载体表面，易受到剪切损伤，不适合贴壁不牢的细胞生长微载体价格较贵，一般不能重复使用需要较高的细胞接种量。3、微囊培养4、悬浮培养三、蛋白质纯化技术1、分子伴侣的种类和作用存在于原核生物和真核生物细胞质以及细胞器中可协助新生肽链正确折叠的一类蛋白质。主要有三大类：伴侣蛋白、热激蛋白70家族和热激蛋白90家族。2、蛋白质错误折叠会

34、引起哪些疾病人的纹状体脊髓变性病，老年痴呆症，亨丁顿氏舞蹈病，帕金斯病，癌症，肺气肿3、蛋白质组学的分类蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等。4、在进行蛋白质纯化前应作哪些工作尽量多地了解目标蛋白的信息一级结构、二硫键、几条肽链-大小、形状、等电点、电荷、溶解度-高级结构特性：含糖否、疏水性、与金属离子的结合、结构域稳定性：热稳定性、pH稳定性、时间稳定性-纯化标签5、蛋白质纯化总结表包括哪些指标（必考）三个测定指标：蛋白浓度、体积、活性五个计算指标：总活性、总蛋白、比活、得率、纯化倍数a、各组分测定的指标：蛋白浓度(mg

35、蛋白/ml)、单位体积蛋白活性(U/ml)、总体积(ml)；b、根据以上指标计算所得指标：总活性(U)=单位体积蛋白活性(U/ml)X总体积(ml)；比活性(U/mg蛋白)=单位体积蛋白活性(U/ml)三蛋白浓度(mg蛋白/ml)；总蛋白(mg)=蛋白浓度(mg蛋白/ml)X总体积(ml)；c、根据以上指标可计算该纯化步骤的效率指标：纯化倍数=某组分比活性/上样时的比活性；得率=某组分的总活性/上样时的总活性6、纯化步骤的组合应遵守什么原则a、尽可能涉及蛋白质分子的不同性质b、尽可能减少中间步骤，如浓缩、除盐、透析等c、纯化步骤的重复使用分子筛：不同分辨率的填料可以有不同的功能(cut,pur

36、ification,polishing)离子交换：重复使用往往有不同的分辨效果，一般在找不到更好的办法时可尝试。7、分子间相互作用力有哪些氢键、离子键、范德华力、配位键、疏水键8、色谱法纯化的常用术语a、基线：当没有待测组分进入检测器时，在实验操作条件下，反映检测器噪声随时间变化的曲线称为基线。稳定的基线是一条直线。b、峰高：从色谱峰顶点到基线的距离叫峰高，以h表示c、峰底宽度Wb：在色谱峰两边的转折点所画的切线与基线相交的截距d、半峰宽：峰高一半处的峰宽度，即从峰高的中点作基线的平行线与峰两侧相交的截距e、峰面积A：峰与基线延长线所包围的面积。9、评价色谱法纯化效率的主要参数保留值：保留时间

37、(tR)、保留体积(VR)、容量因子(k：是比“tR，还常用的保留值，它与柱子的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动相的分配性质、柱温以及相空间比有关。)-柱效:理论塔板数(N)；理论塔板高度(H)不对称因子(Tf)-分离度定义：是色谱图中相邻两峰分离程度的量度。两峰间的分离程度受两峰尖的距离和两峰各自峰宽的制约。10、应用凝胶过滤层析应注意哪些问题a、装柱：均匀、垂直、无气泡b、化学物理稳定性c、上样量：2-5%11、高效液相色谱的柱效用什么表示评价柱效：理论塔板数(N)；理论塔板高度(H)将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另

38、一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作理论塔板。理论塔板数(numberoftheoreticalplate):一个组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数。理论塔板高度(theoreticalplateheight)H：个理论塔板的长度。为使组分在柱内两相间达到一次分配平衡所需要的柱长。12、高效液相色谱系统由哪些部分组成流动相贮液瓶、泵、进样阀、柱、检测器、收集器13、应用膜分离技术需注意什么问题膜分离技术在应用中需注意的原则1、膜孔径的选择对于不同对象，应存在一最佳孔径膜，需用实验来

39、确定，其原因在于不同发酵液中，最小细胞粒子与特性不同。2、组件结构当发酵液中固体含量较低且产物在透过液中时，发酵液首先是要澄清，则选择组件结构余地较大。但若截留物是产物，则组件结构选择要慎重。3、膜的化学特性膜的化学特性对其与被分离溶质间的相互作用有决定性影响。一般而言，电荷相互作用是较常见的。4、膜的结构5、操作参数的选择操作参数包括料液流速、压力、pH值、离子强度和温度等。通常高的料液流速可以减小浓差极化或沉积层的形成、提高透水量。但要考虑有些生物产品对剪切力敏感，必须选择合适的料液流速。在浓差极化现象不严重情况下，通常可用增加压力来提高透水率，但需用实验确定其限度，因为提高压力，会使浓差

40、极化与膜污染加重，到一定压力后“凝胶层”形成，透水率不再随压力提高而增加，因此操作压力要合适，以不形成凝胶层为限。温度通常通过影响料液粘度对透水量产生作用，但在考虑升温时必须注意生物产品活性的稳定性。pH值则对细胞荷电性产生影响。因此对膜的类型选择应给予重视。6、膜的清洗在任何膜分离技术应用中，尽管选择了较合适的膜和适宜的操作条件，在长期运行中，膜的透水量随运行时间增长而下降现象，即膜污染问题必然发生，因此必须采取一定的清洗方法，使膜面或膜孔内污染物去除，达到透水量恢复，延长膜寿命的目的。在清洗程序设计中，通常要考虑下面两个因素：(1)膜的化学特性，膜的化学特性是指耐酸、碱性、耐温性、耐氧化性

41、和耐化学试剂特性，它们对选择化学清洗剂类型、浓度、清洗液温度等极为重要.一般来讲，各生产厂家对其产品化学特性均给出简单说明，当要使用超出说明书的化学清洗剂时，一定要慎重，先做小实验检测是否可能给膜带来危害。(2)污染物特性，这里主要是指它在不同介质中，不同温度下的溶解性、荷电性和它可氧化性及可酶解性等。这样可有的放矢地选择合适化学清洗剂，达到最佳清洗效果。14、包涵体复性的主要方法1、稀释法2、透析法3、超滤法4、层析法稀释法：-优点直接加入水或缓冲液，简便-缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。-目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。透析法：-好处是不增加体积，通

42、过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，-易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。超滤法：-在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，-缺点是有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。层析法：-蛋白质在变性剂存在下，利用其在填料上的反复分配作用，逐步使其构象由U转化为N状态。-优势在于：在进样后可很快脱除变性剂，操作效率高；层析固定相对变性蛋白的吸附可减少变性蛋白在脱除变性剂后形成聚集体，这不仅提高了蛋白质复性的活性收率而且可提高蛋白质复性的初始浓度；在复性的同时可使目标蛋白与杂质分离，特别适合包涵体蛋白的复性；便于回收变性剂，以降低废水处理成本；回收率高（高

43、达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右）。-用于蛋白质复性的层析折叠复性法主要有凝胶过滤（GC）,疏水层折（HIC）、离子交换层析（IEC）和亲和层析法（AC,含金属鳌合色谱）-主要的问题就是复性过程中（可能在进样过程中，或在样品溶液与流动相混合但蛋白未和固定相接触之前）会产生蛋白质聚集体或沉淀15、影响包涵体复性的主要因素蛋白质本身的性质-二硫键的数量，氨基酸的种类，蛋白质的复性效率在20%左右蛋白质的复性浓度一控制在0.1-lmg/mlpH和温度-最适宜的复性pH值一般是8.0-9.0-温度影响反应速度，过高影响蛋白质稳定性其他-变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势和离子强度共溶剂和其他添加剂的存在与否生物检测部分1、作为一个药用重组蛋白需要检测的理化性质有那些？分子量、纯度、等电点、特异性鉴别、紫外光谱扫描、肽图分析、氨基酸组分分析、N末端氨基酸序列、C末端氨基酸序列分析、二硫键的分析2、测定未知蛋白质相对分子量的方法。还原型SDSPAGE电泳分子筛(HPLC)质谱3、检测蛋白质纯度指标的方法。方法分析机制反相HPLC疏水性疏水性相互作用HPLC疏水性毛细管电泳荷质比离子交换HPLC电荷等电聚焦电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳电荷、分子大小SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分子大小分子排阻HPLC分子大小质谱测量法分子大小4